猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组核衣壳蛋白(rN蛋白)为抗原,初步建立了检测PRRSV抗体的rN-ELISA方法。根据GenBank公布的PRRSV VR2332株编码核衣壳蛋白的ORF7基因序列设计合成了一对引物,成功扩增出ORF7基因。将其克隆到PET-30a构成原核表达载体,转化宿主菌BL21(DE3)并获得表达。通过SDS-PAGE和Western blot检测证实rN蛋白获得了高效表达,且具有良好的免疫学活性。以纯化的重组蛋白为抗原建立检测PRRSV抗体的间接ELISA法。试验证明,该方法与IDEXX公司生产的PRRSV抗体检测ELISA试剂盒对同批临床血清样本的检测结果完全相符,且对其他常见的6种猪疫病阳性血清检测均为阴性,无交叉反应。本研究建立的rN-ELISA方法敏感性高、特异性强,可用于猪繁殖与呼吸综合征常规诊断及流行病学的调查研究。     

铜离子对绵羊PrPC重组蛋白结构转化的影响

为探明铜离子在朊蛋白构象转化中的作用机制，进一步研究构象病发生机制提供基础数据，利用DNA重组技术，绵羊朊病毒蛋白在大肠杆菌BL2l（DE3）中高效表达，获得绵羊PrP^C重组蛋白（OvPrP^C），与氯化铜在体外结合。对CuCl2处理后的蛋白进行圆二色谱（CD）和蛋白酶K（PK）消化试验进行转化调节后蛋白抗性分析。结果表明，OvPrP^C分子量为25172．80U，其二级结构主要由α-螺旋构成，含少量β-折叠。经过CuCl2体外调节后，OvPrP^C结构中α-螺旋减少，β-折叠增加。而蛋白酶K消化后，CuCl2作用后的蛋白产生了PK抗性。为进一步的神经细胞毒性试验提供了宝贵的材料，进而为探讨构象病发生机理提供有力的科学依据。     

绵羊PRND基因序列分析

Doppel是一种新发现的朊蛋白样糖蛋白,与PrP相类似,编码Dpl蛋白的基因称作PRND,鼠、人,以及其他哺乳动物的PRND位于PRNP下游16 kb的地方[1].Dpl与PrPC(cellular prion pro-tein)C端的三分之二具有25%的序列同源性;Dpl与PrP在二级结构和拓扑学上具有极大的相似性,均包含3个α螺旋和2个二硫键,但是在N端Dpl则缺乏存在于PrPC中八肽重复区域[2-4].     

狂犬病研究进展

狂犬病是一种急性致死性脑炎疾病。狂犬病病毒(rabies virus)是一种嗜神经性病毒,属于弹状病毒科(Rhabdovi-ridae)狂犬病病毒属(Lyssavirus)。多种野生动物和家畜等可以发生狂犬病病毒的自然感染与传播,并且可以通过咬伤、抓伤或密切接触等形式感染人类而引起狂犬病。在全球范围内,每年约有60000人不幸死于狂犬病,而这些事件大部分发生在亚洲和非洲。狂犬病是人畜共患的自然疫原性传染病,目前尚无有效的治疗方法,一旦发病,死亡率近乎100%,预防狂犬病的发生尤其重要,狂犬病基本上是可以通过暴露后的预防进行阻止的。     

处理重组牛朊蛋白对接种金黄地鼠脑组织朊蛋白的效应

将纯化的重组牛朊蛋白经理化因子处理后,脑内接种金黄地鼠。临床观察200天后,对大脑、小脑和脑干,进行蛋白酶抗性朊蛋白的WesternBlot检测和朊蛋白基因表达绝对定量。结果表明,处理的重组牛朊蛋白对金黄地鼠脑组织检测部位的基因表达有特定的影响;接种后在检测时间内处理重组牛朊蛋白没有导致金黄地鼠脑内酶抗性朊蛋白的出现。研究结果为重组朊蛋白的生物学提供了基础数据。     

牛结核分枝杆菌Mce4E蛋白对牛肺泡巨噬细胞iNOs、TNF-α、IL-6和IL-12表达的影响

探讨Mce4E蛋白在牛结核分枝杆菌致病机理中的作用。以Mce4E蛋白刺激肺泡巨噬细胞24和48h后,MTT检测分析表明,Mce4E蛋白对巨噬细胞的活性有显著的抑制作用(P<0.05);用重组表达的Mce4E蛋白、人分枝杆菌纯化蛋白衍生物(Purified Protein Derivative of M.tuberculosis,MtbPPD)、牛结核分枝杆菌纯化蛋白衍生物(Purified Protein Derivative of M.bovis,MbPPD)、卡介苗(Bacille Calmette Guerin,BCG)和刀豆蛋白A(con-canavalin A,ConA)分别刺激肺泡巨噬细胞48h后,real-time PCR方法检测显示,Mce4E蛋白能够促使牛肺泡巨噬细胞TNF-α和IL-6 mRNA的表达上调(P<0.05)、抑制肺泡巨噬细胞iNO的mRNA表达(P<0.05)而对IL-12表达没有影响(P>0.05)。Mce4蛋白能够促使肺泡巨噬细胞分泌炎性细胞因子,并对肺泡巨噬细胞有抑制作用,证实Mce4蛋白在分枝杆菌中具有重要的作用。     

大鼠大脑皮质神经元的分离及培养

为了给更好地研究神经元病理变化提供物质材料,对新生大鼠大脑皮质神经元进行体外分离和培养。无菌操作取新生大鼠的大脑皮质,采用机械法和胰蛋白酶消化法相结合的方法分离细胞,制备单层细胞悬液接种培养板;5-氟脱氧尿嘧啶处理等方法纯化神经元,甲苯胺蓝染色法及抗NSE单克隆抗体对纯化后的神经元进行鉴定。结果表明,培养的神经元生长良好,形态正常,纯度高达90%以上。采用本方法培养的神经元可作为深入研究中枢系统疾病的细胞模型材料。     

TNF-α在IFN-γ诱导的感染牛分枝杆菌的THP-1细胞凋亡过程中的作用及相关信号通路分析

为研究IFN-γ对感染牛分枝杆菌的THP-1细胞的促凋亡作用,及TNF-α在此细胞凋亡过程中的作用和相关信号分子的变化,使用浓度为15 ng.mL-1的IFN-γ作用于不同剂量牛分枝杆菌北京株(MOI10∶1,20∶1)感染的THP-1细胞,在感染后12、24、36、48和72 h,使用流式细胞仪测定细胞凋亡百分比。结果显示,IFN-γ诱导了M.bovis北京株感染的细胞凋亡,并且凋亡呈时间相关性。随着细胞凋亡百分比的增加,牛分枝杆菌的CFU降低。在IFN-γ和M.bovis北京株(MOI10∶1)处理的巨噬细胞内加入抗TNF-α单克隆抗体,感染后36 h,细胞凋亡百分比测定结果显示,加入抗TNF-α单抗抑制了IFN-γ诱导的M.bovis感染的THP-1细胞的凋亡,与对照组相比,差异显著(P0.05);用分光光度计检测表明Caspase-3和Caspase-8的激活是TNF-α依赖性的。在IFN-γ和M.bovis北京株(MOI10∶1)作用的THP-1细胞内分别加入JNKinhibitor I或NEMO-Binding Domain BindingPeptide,或同时加入2种抑制剂,36 h后测定细胞凋亡情况,与对照组相比,加入抑制剂后,细胞凋亡无显著差异(P0.05),说明在本试验中,JNK通路和NF-κB凋亡通路未被激活。本研究初步阐明了TNF-α在IFN-γ诱导的感染牛分枝杆菌的细胞凋亡过程中的作用及相关信号通路。     

朊蛋白多肽PrP 106-126对N2a细胞活性及PrP mRNA表达的影响

朊病(prion disease)是由正常细胞朊蛋白PrPC错误折叠成异常朊蛋白(朊病毒)引起的.朊病毒的神经致病性在病理学上表现为神经元空泡化、神经元丧失和胶质增生等.     

牛分枝杆菌哺乳动物细胞侵袭蛋白4E的原核表达、纯化及其圆二色谱分析

为了阐明牛分枝杆菌侵入宿主细胞和在肺泡巨噬细胞长期存活的机理，本研究以牛分枝杆菌的DNA为模板，通过PCR的方法扩增克隆牛分枝杆菌哺乳动物细胞侵袭蛋白4E（Mammalian cell-entry protein 4E，mce4E）基因，将所扩增基因克隆于原核表达载体pET30a（＋）并进行测序，结果显示该基因与GenBank上所公布的牛分枝杆菌和人分枝杆菌mce4E基因同源性为100％。将重组表达载体转入宿主菌BL21进行诱导表达，表达蛋白经SDS-PAGE分析和Western-blotting免疫印迹鉴定，结果证明目的蛋白获得高效表达，表达量占菌体总量的53．3％，分子量约为45ku；利用Ni-NTA琼脂糖柱对表达蛋白进行纯化，纯化率大于95％；纯化的蛋白经过透析复性、圆二色谱（CD）测定，结果表明重组蛋白为典型的α螺旋型结构，经Jascow32软件分析计算，mce4E蛋白含有39．1％的α螺旋，60．9％的无规卷曲，无β-折叠和转角，为进一步开展牛分枝杆菌致病机理的研究和寻找新的药物作用靶位点奠定了基础。