牛分枝杆菌哺乳动物细胞侵入蛋白4A(Mce4A)的原核表达、纯化及其圆二色谱分析

将牛分枝杆菌哺乳动物细胞侵入蛋白4A(Mammalian cell-entry protein 4A,Mce4A)基因克隆至原核表达载体pET30a( )中,得到重组表达载体pET30-mce4A,转入宿主菌BL21(DE3)中,获得大量表达,表达量占菌体蛋白总量的52%,大小约为43 Ku。经Ni-NTA琼脂糖亲和层析获得Mce4A重组蛋白;圆二色谱(CD)测定结果表明,Mce4A重组蛋白α螺旋含量为31.1%,β-折叠含量为0%,无规卷曲含量为61.0%,转角含量为7.9%。为进一步开展牛分枝杆菌致病机理的研究和寻找新的药物作用靶位点奠定了基础。     

奶牛李氏杆菌的分离与鉴定

为确定北京某养牛场送检的出现神经症状的病死奶牛的病原,从病牛的脑组织中分离培养到1株革兰阳性球杆菌.通过细菌形态学观察、PCR鉴定和病理组织学观察,结果均显示该菌呈现产单核细胞李氏杆菌的典型特征,结合临床症状,将其鉴定为产单核细胞李氏杆菌.     

PrP106-126诱导的N2a细胞神经毒性中神经营养因子受体p75NTR的表达变化研究

神经元死亡是朊病毒病的主要病理学特征。朊蛋白多肽PrP106-126能够对神经细胞表现神经毒性,引起细胞凋亡。细胞表面蛋白神经营养因子受体p75^NTR的胞外区域可以与PrP106-126结合并产生促凋亡作用。作者以小鼠成神经瘤细胞N2a为细胞模型,应用荧光定量RT-PCR和Western Blot技术,以及DNA Ladder和AnnexinV-FITC/PI双重染色流式细胞凋亡检测技术对p75^NTR介导的PrP106-126神经毒性分子机制进行了研究。结果发现在PrP106-126诱导的N2a细胞凋亡过程中,p75^NTR的mRNA转录水平和蛋白表达水平均显著升高,以p75^NTR多克隆抗体sc-6189阻断PrP 106-126与p75^NTR的相互作用后,减弱了PrP106-126诱导的N2a细胞凋亡效果。该研究揭示了PrP106-126诱导的N2a细胞毒性中p75^NTR受体的表达变化,为解释朊病毒病的发病机制提供了重要数据。     

绵羊组织中朊病毒受体37kDa/67kDa LRP/LRmRNA转录水平研究

本研究旨在检测绵羊组织中朊病毒受体37kDa/67kDa LRP/LR mRNA水平并探讨其与朊病毒组织嗜性的关系.选用背景相似的6只内蒙绵羊,提取组织RNA.反转录RT-PCR构建cDNA模板;利用本研究前期构建的标准质粒及标准曲线,对组织中该受体mRNA水平进行Real-time(实时)荧光定量PCR检测.结果表明,大脑皮质中的受体表达水平最高(P<0.05),其次为心脏和脑干,中等表达的器官依次为海马、小脑、脾脏、丘脑、肠系膜淋巴结、肝脏和肾脏,表达量最低为肺脏(P<0.05).结果提示,朊病毒受体--37kDa/67kDa LRP/LR在绵羊各组织中的表达量高低与朊病毒的复制程度有一定的相关性,受体LRP/LR表达量较高的区域朊病毒复制水平相对较高.结果提示朊病毒入侵机体后,组织器官PrPsc聚集程度可能与受体37kDa/67kDa LRP/LR表达水平相关.     

节尾狐猴暴发结核病的诊断

1发病情况 北京某野生自然动物园饲养的20只节尾狐猴，有6只发病，主要表现为持续性消瘦，食欲不振，体质虚弱，病程1个多月，曾经采用链霉素、青霉素、头孢菌素等药物治疗，未有明显的效果，其中有2只死亡。     

牛分支杆菌Mce4A蛋白对牛肺泡巨噬细胞iNOS、TNF-α、IL-6和IL-12表达的影响

牛分支杆菌侵入巨噬细胞的机制,主要是由哺乳动物细胞侵袭蛋白(Mammalian cell-entry proteins,Mce)介导的,在牛分支杆菌的致病机理中具有重要的作用。为了探讨Mce4A蛋白在牛分支杆菌致病机理中的作用,用不同浓度的重组Mce4A蛋白刺激肺泡巨噬细胞,结果显示,Mce4A蛋白抑制巨噬细胞的活性;用重组Mce4A蛋白、MtbPPD、MbPPD和BCG刺激肺泡巨噬细胞,结果表明,Mce4A蛋白促使肺泡巨噬细胞TNF-α、i NOS和IL-6的表达上调,而对IL-12的表达没有影响。MbPPD和BCG促使肺泡巨噬细胞TNF-α、i NOS、IL-6和IL-12的表达上调;MtbPPD促使肺泡巨噬细胞TNF-α、IL-6和IL-12的表达上调,但是对i NOS的表达却没有影响。由此可见,Mce4A蛋白能够促使巨噬细胞分泌炎性细胞因子,促使机体发生炎性反应,在宿主细胞免疫应答反应中具有重要的作用。     

牛结核分枝杆菌MPB70基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

以牛分枝杆菌DNA为模板,克隆了牛分枝杆菌MPB70基因,构建了克隆载体pGEM-MPB70和表达载体pET30a-MPB70,经IPTG诱导在大肠杆菌BL-21中表达,用SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物并进行蛋白纯化。试验结果表明,牛分枝杆菌MPB70基因体外扩增产物与预期值相符,约582 bp;所构建表达质粒pET30a-MPB70经测序,结果与预期一致;SDS-PAGE分析表明,该融合蛋白以包涵体的形式表达,其分子质量约为29 kD,蛋白表达量约占菌体总蛋白的20%;该蛋白经电洗脱纯化后,纯度达85%以上;免疫印迹分析表明,原核表达的融合蛋白可与兔抗牛分枝杆菌多克隆抗体结合,并且具特异的免疫反应性。     

大鼠睾丸支持细胞体外培养及FSH对其增殖的影响

为探索睾丸支持细胞体外纯化培养的方法,并观察不同水平FSH对支持细胞增殖能力的影响,本研究采用胶原酶Ⅰ和胰蛋白酶序贯两步消化法和低渗处理法分离、纯化睾丸支持细胞,Fas-L免疫荧光法对纯化后的支持细胞进行鉴定。取培养第2代第2天已完全贴壁的支持细胞,在其培养液中添加不同浓度FSH,培养16 h后,MTT法检测FSH对支持细胞增殖能力的影响。结果表明,该方法培养的支持细胞纯度高,且FSH的添加可显著促进支持细胞的增殖(P<0.01),为支持细胞高效制备提供可行性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组核衣壳蛋白(rN蛋白)为抗原,初步建立了检测PRRSV抗体的rN-ELISA方法。根据GenBank公布的PRRSV VR2332株编码核衣壳蛋白的ORF7基因序列设计合成了一对引物,成功扩增出ORF7基因。将其克隆到PET-30a构成原核表达载体,转化宿主菌BL21(DE3)并获得表达。通过SDS-PAGE和Western blot检测证实rN蛋白获得了高效表达,且具有良好的免疫学活性。以纯化的重组蛋白为抗原建立检测PRRSV抗体的间接ELISA法。试验证明,该方法与IDEXX公司生产的PRRSV抗体检测ELISA试剂盒对同批临床血清样本的检测结果完全相符,且对其他常见的6种猪疫病阳性血清检测均为阴性,无交叉反应。本研究建立的rN-ELISA方法敏感性高、特异性强,可用于猪繁殖与呼吸综合征常规诊断及流行病学的调查研究。     

奶牛狂犬病的诊断

狂犬病(rabies)是由弹状病毒科狂犬病毒属狂犬病毒引起的以急性、进行性、致死性脑脊髓炎为主要特征的人兽共患烈性传染病,病死率100%。