天津市锦鲤疱疹病毒PCR检测与序列分析

2017年6月,天津市滨海新区、北辰区等地一些养殖场的锦鲤出现急性死亡,发病3 d后死亡率高达85%以上。病鱼呈现眼部凹陷、烂鳃、内脏出血等临床症状,初步诊断为锦鲤疱疹病毒病。针对锦鲤疱疹病毒(KHV/CyHV)的TK、SphI-5、ORF25、ORF56、ORF81基因设计特异性引物,建立PCR方法进行KHV基因检测。结果显示:死亡疑似病例的KHV检测阳性;测序获得的TK、SphI-5、ORF25、ORF56、ORF81基因片段长度分别为409、300、317、939和156bp,与CyHV-3-J2病毒株基因序列同源性为97.6%～100%。系统发育树分析显示,其与CyHV-3亲缘关系最近,自然聚为一支,最终确定为CyHV-3型。以上研究为锦鲤疱疹病毒病的分子诊断及流行病学调查奠定了基础。     

凡纳滨对虾肠道中地衣芽孢杆菌的分离鉴定及其生物学特性

为筛选对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)具有潜在益生效果的菌株,从体质量为(3.1±0.4)g的健康凡纳滨对虾肠道中筛选出一株具有耐高温(80℃)能力的菌株(命名为RHVJ),采用形态学观察、生理生化鉴定、基因序列比对、病原菌拮抗能力测定、安全性与耐受性分析和生长特性检测等方法对其展开研究。结果表明：菌株RHVJ为革兰氏阳性杆菌,综合其生理生化特征可初步鉴定该菌属于芽孢杆菌属(Bacillus);菌株RHVJ的16S rDNA序列与地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的MH305331.1和NR074923.1完全匹配,其gyrB序列与CP038186.1和CP023729.1也达到了100%的一致性;综合菌体形态、生理生化及分子生物学特征,判定菌株RHVJ为地衣芽孢杆菌;地衣芽孢杆菌RHVJ可抑制副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)生长,对凡纳滨对虾无致病性;在胆盐质量浓度为0～1.2 g/L、pH为3～11环境下培养,以及在37～90℃下进行5min或15 mi...     

锦鲤厦门希瓦氏菌的分离鉴定及药敏试验

[目的]明确引起锦鲤发病死亡的原因及其病原菌的药敏特性,为生产中有效防治该病提供科学依据.[方法]采用常规方法从患病锦鲤的肝脏中分离病原菌,经形态观察、生理生化鉴定和16SrDNA序列分析确定其种属,通过人工感染试验判断病原菌的致病性,并以纸片扩散法测定其药物敏感性.[结果]综合分离菌株的形态特征、生理生化特性及16SrDNA序列分析结果,可确定其为厦门希瓦氏菌(Shewanella xiamenensis).人工感染试验证明,从患病锦鲤肝脏分离获得的厦门希瓦氏菌具有较强毒力,其对斑马鱼的半数致死量(LD50)为2.30×104CFU/mL.厦门希瓦氏菌对阿莫西林、红霉素、头孢克肟、头孢哌酮、头孢噻肟、美罗培南、亚胺培南、阿奇霉素、克林霉素、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素和氟苯尼考等14种药物高度敏感,但对氨苄西林、左氧氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、利福平、链霉素、依诺沙星、磺胺异恶唑和甲氧嘧啶等抗生素已产生耐药性.[结论]厦门希瓦氏菌可感染引起锦鲤发病死亡,且具有较强毒力,实际生产中可选用阿莫西林、美罗培南、亚胺培南、庆大霉素、新霉素、卡那霉素、头孢哌酮、头孢克肟、头孢噻肟和阿奇霉素等抗生素进行防治.     

鲇源异嗜糖气单胞菌的分离鉴定及药敏特性

从发病鲇鱼体内分离出1株革兰氏阴性细菌SJ-2,通过细菌形态学观察、理化特性、16S rDNA测序以及构建系统发育进化树分析,表明SJ-2菌株葡萄糖产气、氧化酶、硝酸盐还原为阳性,鸟氨酸脱羧酶、硫化氢为阴性等;进一步采用PCR方法扩增16S rDNA序列,测序获得片段大小为1 401 bp,与Aeromonas allosaccharophila模式菌株ATCC51208序列相似性达99.64%;构建系统发育树分析显示分离菌与Aeromonas allosaccharophila自然聚为一支,最终判定SJ-2菌株为异嗜糖气单胞菌(A.allosaccharophila)。人工腹腔注射斑马鱼死亡率达100%,病鱼呈现体色变白、腹水等症状。药敏试验结果显示对头孢克肟、头孢哌酮、头孢噻肟、诺氟沙星、左氟沙星、氟苯尼考等药物敏感,对阿莫西林、氨苄西林、磺胺异唑、复方新诺明等耐药。首次报道鲇源异嗜糖气单胞菌的分子鉴定与药敏特性,旨在为该病防治提供参考。     

革胡子鲶骨骼系统研究

[目的]研究革胡子鲶骨骼系统的组成及形态学特征。[方法]常规煮沸剥离方法得到完整骨骼标本和单个骨骼标本,对标本进行摄影与分析,并总结出相应的骨骼特征。[结果]革胡子鲶的骨骼系统具有单个犁骨,鳃盖边缘有棘,无眶蝶骨,腰带简单,有韧带与肩带相连。无骨鳞,无肌间骨,无续骨、顶骨,第3、4椎骨彼此固结。胸鳍具有1枚强大且坚硬的骨质棘,具有14对腹肋。共有骨骼426块,其中脑颅区域25块,咽颅区域71块,附肢骨骼234块,躯干部分96块。[结论]革胡子鲶骨骼系统具有一般硬骨鱼类的基本特征,同时此种鱼类的骨骼结构也具有鲶形目的特点。     

泛影葡胺密度梯度离心法纯化近江牡蛎类立克次体

用国产泛影葡胺做介质,通过差速离心和密度梯度离心从患病近江牡蛎的鳃、外套膜、肝胰腺组织中纯化类立克次体。纯化的类立克次体在透射电镜下观察,20％-25％和25％-30％之间的条带为纯净的类立克次体,大多数呈球形、椭球形,偶见哑铃状（处于二分裂阶段）。纯化的类立克次体细胞形态完整,在光滑的细胞壁外围有一层疏松的粘液层,而且多个类立克次体常聚集在一起。利用APIZYM半定量法对类立克次体进行酶谱分析,检测到了11种酶,包括碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、酯酶（C4）、类脂酯酶（C8）、亮氨酸芳胺酶、萘酚AS—BI-磷酸水解酶、β-半乳糖苷酶、N-乙酰葡萄糖胺酶、β-果糖酶、β-糖醛酸苷酶和缬氨酸芳胺酶。本实验证明,国产泛影葡胺是直接从患病贝类组织中纯化类立克次体的良好介质。     

间接ELISA技术检测近江牡蛎病原-类立克次体

以近江牡蛎病原-类立克次体为抗原,制备鼠抗血清,利用辣根过氧化酶标记的羊抗鼠血清(HRP-IgG)为酶标二抗,建立了检测近江牡蛎类立克次体的间接ELISA快速检测方法.结果表明,应用间接ELISA技术检测近江牡蛎类立克次体有较高的灵敏度,最低的检测量为50 ng的全菌抗原蛋白量.同时交叉反应试验表明该方法具有较高的特异性.利用建立的间接ELISA技术,对50份自然患病的近江牡蛎鳃组织进行类立克次体检测,阳性率为89%.