天津市锦鲤疱疹病毒PCR检测与序列分析

2017年6月,天津市滨海新区、北辰区等地一些养殖场的锦鲤出现急性死亡,发病3 d后死亡率高达85%以上。病鱼呈现眼部凹陷、烂鳃、内脏出血等临床症状,初步诊断为锦鲤疱疹病毒病。针对锦鲤疱疹病毒(KHV/CyHV)的TK、SphI-5、ORF25、ORF56、ORF81基因设计特异性引物,建立PCR方法进行KHV基因检测。结果显示:死亡疑似病例的KHV检测阳性;测序获得的TK、SphI-5、ORF25、ORF56、ORF81基因片段长度分别为409、300、317、939和156bp,与CyHV-3-J2病毒株基因序列同源性为97.6%～100%。系统发育树分析显示,其与CyHV-3亲缘关系最近,自然聚为一支,最终确定为CyHV-3型。以上研究为锦鲤疱疹病毒病的分子诊断及流行病学调查奠定了基础。     

间接ELISA技术检测近江牡蛎病原-类立克次体

以近江牡蛎病原-类立克次体为抗原,制备鼠抗血清,利用辣根过氧化酶标记的羊抗鼠血清(HRP-IgG)为酶标二抗,建立了检测近江牡蛎类立克次体的间接ELISA快速检测方法.结果表明,应用间接ELISA技术检测近江牡蛎类立克次体有较高的灵敏度,最低的检测量为50 ng的全菌抗原蛋白量.同时交叉反应试验表明该方法具有较高的特异性.利用建立的间接ELISA技术,对50份自然患病的近江牡蛎鳃组织进行类立克次体检测,阳性率为89%.     

半滑舌鳎细胞分裂周期蛋白42基因克隆与结构预测

细胞分裂周期蛋白42(Cdc42)是Rho超家族酶中的一个亚类,具有调节细胞骨架和肌动蛋白作用,并参与免疫与炎症反应。设计半滑舌鳎Cdc42基因（即CsCdc42）特异性引物,采用RT-PCR方法、生物信息学方法等进行CsCdc42基因克隆及结构预测。结果获得CsCdc42基因片段长度为847 bp,推测编码191个氨基酸,含有7个抗原表位（27-28、61-63、90-92、120-122、131-133、164-166和181-183 aa）、1个RHO结构域（6-179 aa）,其中含有1个ATP/GTP结合位点和1个酰基化位点;蛋白结构预测主要为α螺旋（30.9%）、β折叠（24.6%）和无规则卷曲（44.5%）。序列比对结果表明,CsCdc42与斑马鱼、青鳉、虹鳟、大菱鲆和虾等氨基酸序列同源性分别为99.43%、97.91%、95.81%、94.76%和91.10%;构建系统发育树显示Cs Cdc42与斑马鱼、人和海水鱼类Cdc42亲缘关系最近,自然聚为一支。以上结果为研究半滑舌鳎细胞分裂周期蛋白相关基因功能提供科学参考。     

牙鲆细胞因子M17蛋白原核表达及其多克隆抗体制备

M17是鱼类细胞因子IL-6亚族家族的成员之一,具有细胞因子样功能,在鱼体内发挥抗病毒和抗细菌的作用。为了制备牙鲆(Paralichthys olivaceus)M17蛋白的多克隆抗体,将M17基因插入pET-32a原核表达载体,构建M17基因原核表达质粒p ET-32a-M17。将构建的质粒pET-32a-M17转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞,通过IPTG诱导M17蛋白表达,利用NiNTA亲和层析柱纯化M17重组蛋白。利用纯化的重组M17蛋白免疫小鼠获得M17多克隆抗体(抗血清)。结果显示,IPTG诱导后M17蛋白分子质量大小约为50.0 ku,M17重组蛋白主要以包涵体表达为主;Ni-NTA亲和层析柱纯化后透析复性后M17重组蛋白浓度为597μg·mL^-1;多克隆抗体经双向琼脂免疫扩散法检测抗体效价为1∶16,经Western blotting分析可见单一目的条带,说明制备的多克隆抗体具有较强的特异性。综上可知,M17重组蛋白表达成功,且制备的抗M17多克隆抗体可用于M17蛋白的生物学功能研究。     

鲇源异嗜糖气单胞菌的分离鉴定及药敏特性

从发病鲇鱼体内分离出1株革兰氏阴性细菌SJ-2,通过细菌形态学观察、理化特性、16S rDNA测序以及构建系统发育进化树分析,表明SJ-2菌株葡萄糖产气、氧化酶、硝酸盐还原为阳性,鸟氨酸脱羧酶、硫化氢为阴性等;进一步采用PCR方法扩增16S rDNA序列,测序获得片段大小为1 401 bp,与Aeromonas allosaccharophila模式菌株ATCC51208序列相似性达99.64%;构建系统发育树分析显示分离菌与Aeromonas allosaccharophila自然聚为一支,最终判定SJ-2菌株为异嗜糖气单胞菌(A.allosaccharophila)。人工腹腔注射斑马鱼死亡率达100%,病鱼呈现体色变白、腹水等症状。药敏试验结果显示对头孢克肟、头孢哌酮、头孢噻肟、诺氟沙星、左氟沙星、氟苯尼考等药物敏感,对阿莫西林、氨苄西林、磺胺异唑、复方新诺明等耐药。首次报道鲇源异嗜糖气单胞菌的分子鉴定与药敏特性,旨在为该病防治提供参考。     

凡纳滨对虾肠道中地衣芽孢杆菌的分离鉴定及其生物学特性

为筛选对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)具有潜在益生效果的菌株,从体质量为(3.1±0.4)g的健康凡纳滨对虾肠道中筛选出一株具有耐高温(80℃)能力的菌株(命名为RHVJ),采用形态学观察、生理生化鉴定、基因序列比对、病原菌拮抗能力测定、安全性与耐受性分析和生长特性检测等方法对其展开研究。结果表明：菌株RHVJ为革兰氏阳性杆菌,综合其生理生化特征可初步鉴定该菌属于芽孢杆菌属(Bacillus);菌株RHVJ的16S rDNA序列与地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的MH305331.1和NR074923.1完全匹配,其gyrB序列与CP038186.1和CP023729.1也达到了100%的一致性;综合菌体形态、生理生化及分子生物学特征,判定菌株RHVJ为地衣芽孢杆菌;地衣芽孢杆菌RHVJ可抑制副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)生长,对凡纳滨对虾无致病性;在胆盐质量浓度为0～1.2 g/L、pH为3～11环境下培养,以及在37～90℃下进行5min或15 mi...     

革胡子鲶骨骼系统研究

[目的]研究革胡子鲶骨骼系统的组成及形态学特征。[方法]常规煮沸剥离方法得到完整骨骼标本和单个骨骼标本,对标本进行摄影与分析,并总结出相应的骨骼特征。[结果]革胡子鲶的骨骼系统具有单个犁骨,鳃盖边缘有棘,无眶蝶骨,腰带简单,有韧带与肩带相连。无骨鳞,无肌间骨,无续骨、顶骨,第3、4椎骨彼此固结。胸鳍具有1枚强大且坚硬的骨质棘,具有14对腹肋。共有骨骼426块,其中脑颅区域25块,咽颅区域71块,附肢骨骼234块,躯干部分96块。[结论]革胡子鲶骨骼系统具有一般硬骨鱼类的基本特征,同时此种鱼类的骨骼结构也具有鲶形目的特点。     

泛影葡胺密度梯度离心法纯化近江牡蛎类立克次体

用国产泛影葡胺做介质,通过差速离心和密度梯度离心从患病近江牡蛎的鳃、外套膜、肝胰腺组织中纯化类立克次体。纯化的类立克次体在透射电镜下观察,20％-25％和25％-30％之间的条带为纯净的类立克次体,大多数呈球形、椭球形,偶见哑铃状（处于二分裂阶段）。纯化的类立克次体细胞形态完整,在光滑的细胞壁外围有一层疏松的粘液层,而且多个类立克次体常聚集在一起。利用APIZYM半定量法对类立克次体进行酶谱分析,检测到了11种酶,包括碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、酯酶（C4）、类脂酯酶（C8）、亮氨酸芳胺酶、萘酚AS—BI-磷酸水解酶、β-半乳糖苷酶、N-乙酰葡萄糖胺酶、β-果糖酶、β-糖醛酸苷酶和缬氨酸芳胺酶。本实验证明,国产泛影葡胺是直接从患病贝类组织中纯化类立克次体的良好介质。