PrP106-126诱导的N2a细胞神经毒性中神经营养因子受体p75NTR的表达变化研究

神经元死亡是朊病毒病的主要病理学特征。朊蛋白多肽PrP106-126能够对神经细胞表现神经毒性,引起细胞凋亡。细胞表面蛋白神经营养因子受体p75^NTR的胞外区域可以与PrP106-126结合并产生促凋亡作用。作者以小鼠成神经瘤细胞N2a为细胞模型,应用荧光定量RT-PCR和Western Blot技术,以及DNA Ladder和AnnexinV-FITC/PI双重染色流式细胞凋亡检测技术对p75^NTR介导的PrP106-126神经毒性分子机制进行了研究。结果发现在PrP106-126诱导的N2a细胞凋亡过程中,p75^NTR的mRNA转录水平和蛋白表达水平均显著升高,以p75^NTR多克隆抗体sc-6189阻断PrP 106-126与p75^NTR的相互作用后,减弱了PrP106-126诱导的N2a细胞凋亡效果。该研究揭示了PrP106-126诱导的N2a细胞毒性中p75^NTR受体的表达变化,为解释朊病毒病的发病机制提供了重要数据。     

绵羊组织中朊病毒受体37kDa/67kDa LRP/LRmRNA转录水平研究

本研究旨在检测绵羊组织中朊病毒受体37kDa/67kDa LRP/LR mRNA水平并探讨其与朊病毒组织嗜性的关系.选用背景相似的6只内蒙绵羊,提取组织RNA.反转录RT-PCR构建cDNA模板;利用本研究前期构建的标准质粒及标准曲线,对组织中该受体mRNA水平进行Real-time(实时)荧光定量PCR检测.结果表明,大脑皮质中的受体表达水平最高(P<0.05),其次为心脏和脑干,中等表达的器官依次为海马、小脑、脾脏、丘脑、肠系膜淋巴结、肝脏和肾脏,表达量最低为肺脏(P<0.05).结果提示,朊病毒受体--37kDa/67kDa LRP/LR在绵羊各组织中的表达量高低与朊病毒的复制程度有一定的相关性,受体LRP/LR表达量较高的区域朊病毒复制水平相对较高.结果提示朊病毒入侵机体后,组织器官PrPsc聚集程度可能与受体37kDa/67kDa LRP/LR表达水平相关.     

长风破浪会有时 直挂云帆济沧海——湖北省森林公安局近10年发展掠影

<正>湖北省森林公安机构始建于1958年。经过近60年的发展壮大,特别是近10年来,在国家林业局森林公安局、省林业厅和省公安厅的正确领导下,全省森林公安围绕生态文明建设大局,大力推进和谐林区建设与队伍自身建设,实现了森林公安工作科学发展、跨越式发展。攻坚克难"三大战役"突破发展瓶颈曾几何时,不少森林公安机关自组建以来就一直是"三无(无正规编制、无正常经费、无办公用房)"机构,怎么看都不像一支正规军,而像一支"游击队"。面对这一困境,湖北省森林公安局开始了向落后宣战的"三大战役"——理顺管理体制、解决人员身份、落实经费保障。     

猪瘟RT-PCR ELISA诊断方法的建立

将RT—PCR方法和高灵敏度的地高辛检测系统相结合，先建立猪瘟病毒（classicalswinefevervirus，CSFV）的RT—PCR方法，用地高辛标记RT—PCR产物；再建立CSFV的PCR—ELISA方法，用生物素标记的探针在链亲和素包被的微量板孔中杂交捕获地高辛标记的PCR产物，最后进行免疫显色得出结果。试验主要对RT—PCRELISA的各种反应条件进行了优化，确定了1mg／L的链亲和素、50μg／L生物素标记的探针、1：3000抗地高辛的过氧化物酶、37C杂交2h等为最适反应条件。该方法的敏感性比常规琼脂糖凝胶电泳检测高100倍以上，克服了组织样品中CSFV含量少而难以检测的困难，为猪瘟的早期诊断和分子流行病学调查提供了一条新途径。     

牛分支杆菌Mce4A蛋白对牛肺泡巨噬细胞iNOS、TNF-α、IL-6和IL-12表达的影响

牛分支杆菌侵入巨噬细胞的机制,主要是由哺乳动物细胞侵袭蛋白(Mammalian cell-entry proteins,Mce)介导的,在牛分支杆菌的致病机理中具有重要的作用。为了探讨Mce4A蛋白在牛分支杆菌致病机理中的作用,用不同浓度的重组Mce4A蛋白刺激肺泡巨噬细胞,结果显示,Mce4A蛋白抑制巨噬细胞的活性;用重组Mce4A蛋白、MtbPPD、MbPPD和BCG刺激肺泡巨噬细胞,结果表明,Mce4A蛋白促使肺泡巨噬细胞TNF-α、i NOS和IL-6的表达上调,而对IL-12的表达没有影响。MbPPD和BCG促使肺泡巨噬细胞TNF-α、i NOS、IL-6和IL-12的表达上调;MtbPPD促使肺泡巨噬细胞TNF-α、IL-6和IL-12的表达上调,但是对i NOS的表达却没有影响。由此可见,Mce4A蛋白能够促使巨噬细胞分泌炎性细胞因子,促使机体发生炎性反应,在宿主细胞免疫应答反应中具有重要的作用。     

牛分枝杆菌感染引起牛肺脏脾脏和淋巴结的病理学变化

为研究牛结核病的发生发展规律,为牛结核病的诊断提供病理依据,通过牛分枝杆菌致弱株鼻腔吸入的方式感染犊牛,利用H.E.染色在光学显微镜下观察病牛的病理组织学变化。结果表明,牛分枝杆菌主要侵害病牛的呼吸系统和免疫系统,镜下可见肺脏中出现特异性的肉芽肿结构和炎性灶,淋巴结中出现特异性的肉芽肿结构、炎性坏死灶和淋巴细胞减少,脾脏中红髓白髓界限不清,淋巴细胞减少。     

犬皮肤组织细胞肿瘤的病理学观察与分析

对犬皮肤组织细胞肿瘤典型临床病例进行病理学分析,明确此类肿瘤分类,讨论该类肿瘤病理学特点,为临床诊断犬皮肤组织细胞肿瘤提供有效参考。中国农业大学国家动物海绵状脑病实验室于2016~2017年间,从中国农业大学动物医院陆续收集共28例临床有关病例,通过制作病理切片、HE染色、镜下观察等步骤,进行病理学鉴别诊断,比较肿瘤的临床变化与病理组织形态。结果表明,分析、归纳犬皮肤组织细胞瘤、组织细胞肉瘤临床与病理学特征,为今后确诊此类肿瘤提供有用建议。犬皮肤组织细胞瘤、组织细胞肉瘤见于各个品种犬只,组织细胞肉瘤发病率相对较低;犬皮肤组织细胞瘤多发于头部和耳缘部,组织细胞肉瘤中多发于关节与四肢部,两类肿瘤具有特有的组织病理学形态。     

免疫印迹法检测绵羊朊蛋白prpc的研究

蛋白免疫印迹法在目前已有的朊病检测方法中具有敏感性和特异性高的特点,是检测痒病的金标准。本实验室为国家动物海绵状脑病实验室,负责检测北方地区的牛羊海绵状脑病,自2003年成立以来,在羊痒病流行病学调查、痒病易感性相关分子机理方面及病理组织学检查、免疫组织化学检测法等领域进行了广泛深入的研究,同时基本建立了羊痒病免疫印迹检测方法。     

绵羊朊蛋白PrP~C51-216蛋白酶K抵抗片段的克隆原核表达及纯化

根据绵羊朊蛋白基因(prion protein nucleic acid,PrNP)序列,截去PrNP部分N端信号肽(150 bp)和C端GPI锚定位点(123 bp)形成PrNPT-08,设计特异性引物,以绵羊全血提取DNA为模板,扩增PrNPT-08序列。与表达载体pET30a(+)连接,转化入BL21(DE3)感受态细胞。用IPTG诱导表达,其产物经SDS-PAGE电泳、纯化、Western blotting验证。结果表明,所插入的克隆片段含有498个核苷酸,共编码166个氨基酸,序列对比分析表明,与GenBank中绵羊朊蛋白基因序列同源性为99.6%,氨基酸序列同源性为98.8%。PrNP T-08基因在大肠杆菌得到高效表达,表达产物为相对分子量为27 kDa的融合蛋白,并能被PrP单克隆抗体AH6所识别。该蛋白成功表达为研究朊蛋白生理生化功能和结构转变提供了基础生物学材料,同时为朊蛋白疾病诊断中所需单克隆抗体的制备提供基本的试验材料。     

绵羊重组朊蛋白的原核表达与结构分析

利用DNA重组技术,将绵羊朊病毒正常成熟蛋白基因OvPrP~C插入表达载体pET30a,在大肠杆菌BL21 (DE3)中高效表达,获得的表达产物为绵羊朊蛋白OvPrP(23～256)。经SDS-PAGE分析,表达产物以包涵体形式存在。将包涵体蛋白用8mol/L尿素溶解,在变性条件下经Ni-NTA柱亲和层析纯化,而镍柱能竞争性结合含有6×His标签的pET30a表达的目的蛋白。由于目的蛋白是在变性条件下纯化的,需要将其复性后才能恢复天然构象。采用梯度尿素透析复性后,复性率为25%左右。为了进行重组朊蛋白的结构分析,将重组蛋白进行超滤浓缩,至蛋白浓度为0．4mg/mL时,采用远紫外线圆二色谱(CD)分析其二级结构,并对其高级结构进行了预测。结果表明：通过Western-blotting鉴定,表达的绵羊朊病毒正常成熟蛋白OvPrP(23～256)的分子量为25172．80u左右。经过Jascow32软件分析后,测得OvPrP(23～256)的二级结构含量为：α螺旋为39．4%,β折叠为0%,转角为0%,无规卷曲为60．6%。绵羊重组朊蛋白高级结构的分析为朊病毒疾病的发生机理的探讨提供科学依据。