鸡PERK的原核表达及多克隆抗体的制备

根据鸡的蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)基因序列进行抗原肽分析,选择含大片段抗原表位区约1 500 bp的一段基因(15~1 515 bp)设计一对特异性引物后进行RT-PCR扩增,并构建pET-32a(+)-PERK重组质粒,将其转化至BL21(DE3)感受态细胞中.优化诱导表达条件,纯化重组蛋白后免疫兔并制备多克隆抗体.PCR鉴定、酶切鉴定和测序结果表明,pET-32a(+)-PERK重组质粒构建成功.SDS-PAGE电泳鉴定结果表明,重组蛋白在1.0 mmol·L-1IPTG、25℃下诱导9 h时的表达量最大.蛋白纯化结果表明,100 mmol·L-1咪唑洗脱液可较好地洗脱重组蛋白,获得较多的纯化蛋白.免疫结束后,抗体效价检测结果表明,制备的多克隆抗体效价达1∶32 000,可以与重组蛋白特异结合.     

鸡真核生物翻译起始因子2α的原核表达与多克隆抗体的制备

为了获得鸡源真核生物翻译起始因子2α(Eukaryotic translation initiation factor alpha two,eIF2α)的多克隆抗体,首先经RT-PCR扩增了eIF2α基因的完整编码序列,并成功构建了重组表达质粒pET-32a(+)-eIF2α。将其转化BL21(DE3)经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示成功表达出分子量约51 ku的重组融合蛋白。该融合蛋白表达时的最佳诱导时间、诱导温度和IPTG浓度分别为10 h、45℃和1.5 mmoL/L。通过对该蛋白进行Ni~(2+)柱亲和层析纯化,得到了较高纯度的重组蛋白。将纯化后的eIF2α蛋白免疫新西兰黄兔,制备的多克隆抗体ELISA效价达1∶8 000,试验结果为后续eIF2α蛋白功能的研究提供了帮助。     

番鸭呼肠孤病毒YB株σC蛋白同源性分析及B细胞表位预测

为预测番鸭呼肠孤病毒(DRV)YB株σC蛋白二级结构和B细胞抗原表位,对DRV YB株的σC蛋白氨基酸序列与参考DRV相应序列以DNAStar软件进行同源性和遗传进化树分析;采用SOPMA法、Gamier-Robson法、Chou-Fasman法和Karplus-Schultz法方法预测其二级结构;用Hopp-Woods法、Emini法、Jameson-Wolf法和吴玉章等建立的方法分别预测蛋白的亲水性、表面可能性和抗原指数,然后综合分析其B细胞抗原表位.结果显示,DRV YB与国内DRV相应序列同源性在93.7％～99.6％,代表性较强;B细胞表位可能在15～27、36～49、40～49及90～98区段或其附近,这4个被预测的表位均含有β-转角和无规卷曲结构.本研究为进一步确定σC蛋白的B细胞表位和反向()计提供了理论基础.     

猪伪狂犬病病毒FZ株的分离鉴定

从福州郊区某猪场发生疑似伪狂犬病的仔猪中分离到一株病毒。该病毒株感染Vero细胞、MDCK细胞均可产生典型的细胞病变,并可见合胞体。感染仔猪症状较轻,但在攻毒后25d,可检测到伪狂犬病抗体,并在仔猪的肺气管冲洗液中回收到同样理化特性的病毒。接种成兔和小白鼠均可出现典型的伪狂犬病症状。电镜观察可见110～180nm大小不等、不规则圆形、有囊膜的伪狂犬病毒粒子。用MDCK细胞测定其TCID50为10-6.604/0.1mL,能被PRV标准阳性血清所中和,效价为1∶77。对乙醚、热、胰蛋白酶敏感,在pH5.0～9.0之间保持稳定。尿囊膜接种9～12日龄鸡胚,86h可见尿囊膜水肿、出血,有大小不一白色痘斑样病灶,胚体萎缩,头盖部突起、全身弥漫性出血。制作细胞飞片,8h用PRV荧光抗体染色,可观察到细胞浆内呈现散在的翠绿色荧光。PCR反应可扩增出特异性1579bpDNA片段。证实分离的病毒株为伪狂犬病病毒,并命名为PRVFZ株。     

影响鸡传染性法氏囊病毒抗原(HQ株)效价因素的探讨

抗原效价高低是评价疫苗质量的一项重要指标,目前各厂家的法氏囊疫苗免疫效果不佳,其中一个重要原因就是法氏囊抗原效价不高。试验旨在探讨影响鸡传染性法氏囊病毒抗原(HQ株)效价的因素,从而优化生产工艺参数提升抗原效价,从而提升法氏囊疫苗产品的免疫效果。本试验通过对比不同细胞传代比例,维持液pH,接毒量,接毒时间,收毒时间,接毒后培养温度,维持液血清含量生产抗原的病毒效价,从而选择最佳的工艺参数生产法氏囊抗原。结果表明:传代分种比例小细胞密度大的细胞接毒后病毒效价高,接毒后维持液pH7.8比pH 7.4的病毒抗原效价高;1%种毒接毒量效价最高,细胞培养至24~48h接毒,抗原效价差别小;接毒后36h收毒为最佳收毒时间,接毒后细胞培养温度为37℃最佳;接毒后维持液中血清含量为2%时抗原效价最高。综上,本试验获得了鸡传染性法氏囊病毒(HQ株)疫苗的最佳生产工艺参数,为生产出高效价的传染性法氏囊病毒抗原(HQ株)提供基础数据。     

禽(番鸭)呼肠孤病毒TaqMan探针荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

为了建立检测(番鸭)呼肠孤病毒(DRV)感染的方法,本研究根据DRV的σNS基因核苷酸序列设计引物及TaqMan探针,经过反应条件的优化,建立了该病毒的TaqMan探针实时荧光RT-PCR检测方法.用已知浓度的重组质粒为标准品,构建的标准曲线的相关系数达到99%.试验表明,该方法的重复性、稳定性、特异性良好,且灵敏度高,可以检测到1.0×10~2拷贝/μL的标准品,比普通PCR至少高100倍.该检测方法对DRV人工感染番鸭肝脏组织检出率达到100%.本实验所建立的TaqMan探针荧光RT-PCR为的快速检测以及进行分子流行病学的调查提供了新的技术手段.     

番鸭呼肠孤病毒感染对雏番鸭肠黏膜组织结构及肠道免疫细胞的影响

为探究番鸭呼肠孤病毒(MDRV)感染对雏番鸭肠黏膜免疫的影响,本研究将100只1日龄MDRV抗原抗体阴性雏番鸭随机分为二组:空白对照组(NCG)和MDRV同居感染组(CIG),利用人工感染发病的20只番鸭对GIC组番鸭进行同居感染。NCG和CIG组番鸭分别于后者同居感染1 d、3 d、6 d、10 d、15 d、21 d后采集其十二指肠、空肠、回肠样品进行肠道形态结构(绒毛高度、宽度、V/C值、肠壁厚度、绒毛表面积)的观察及免疫相关细胞(上皮内淋巴细胞、杯状细胞、肥大细胞)的检测。结果显示:与NCG相比,CIG番鸭肠道绒毛高度下降、宽度变窄,排列稀疏,V/C值降低,绒毛表面积下降,肠壁厚度变薄,上皮内淋巴细胞、杯状细胞、肥大细胞数量下降,尤其是同居感染6 d以后其各项检查指标均与NCG差异极显著(p0.01)。表明MDRV可导致肠道消化吸收功能障碍和黏膜免疫抑制。该研究结果进一步充实MDRV感染的致病机制。     

猴头菇多糖对呼肠孤病毒感染番鸭组织病变及细胞凋亡的影响

为探讨猴头菇多糖对呼肠孤病毒感染雏番鸭组织病变及细胞凋亡的影响。本实验通过建立呼肠孤病毒感染的肝脾组织病变的动物模型,应用猴头菇多糖对感染番鸭进行防治,给药组分别添加0.01%,0.02%,0.03%的猴头菇多糖,观察其对肝脾组织病变及其细胞凋亡的影响。实验结果发现给药组的番鸭发病时间延迟、死亡率下降,细胞病变坏死较少,用中剂量的猴头菇多糖的治疗呼肠孤病毒病效果最明显。实验数据还表明猴头菇多糖给药组在病毒感染的早期促进细胞凋亡,晚期抑制细胞凋亡,这可能是猴头菇多糖能对呼肠孤病毒感染产生积极影响的原因,它有助于防止病毒在细胞中的扩散甚至有利于病毒的清除。此项研究为国内首次报道。     

原核表达番鸭呼肠孤病毒σC与σB蛋白对雏番鸭的免疫保护

【目的】探讨原核表达的番鸭呼肠孤病毒（DRV）外壳蛋白σC与σB对于雏番鸭的免疫保护作用,为研制有效的DRV亚单位疫苗提供理论基础。【方法】对pET-30a-S3/BL21重组菌与pET-30a-S4 ORF2/BL21重组菌进行稳定性检验,表达的重组蛋白进行纯化和复性后,进行油乳剂制备,50只1日龄雏番鸭随机平均分为5组,即DRV σB蛋白免疫组、DRV σC蛋白免疫组、DRV σB + σC蛋白免疫组及PBS对照组和攻毒对照组,免疫组皮下接种剂量为500 μg/只,7日龄时进行二次免疫,14日龄时进行攻毒试验,ELISA和琼扩（AGP）检测抗体水平并计算保护指数。【结果】重组菌具有良好的稳定性,各免疫组的雏番鸭均在第2次免疫后7 d产生了一定效价的抗体,其中DRV σB + σC蛋白免疫组和DRV σC蛋白免疫组的雏番鸭血清抗体ELISA效价均为1﹕200,高于DRV σB蛋白免疫组的1﹕100。攻毒保护试验结果表明,联合免疫的保护指数最高,可达70,重组DRV σC保护指数次之,为60,重组DRV σB蛋白保护指数最低,仅为40。【结论】使用原核表达的DRV外壳蛋白σC与σB制备油乳剂,联合免疫可诱导雏番鸭快速产生一定效价的抗体,并提供良好的免疫保护力。     

番鸭呼肠病毒抗体间接ELISA方法的建立

用硫酸铵粗提的番鸭呼肠病毒作为包被抗原,成功地建立了检测番鸭呼肠病毒抗体的间接ELISA方法。结果表明,包被抗原作1∶80稀释,待检血清作1∶40稀释,酶标二抗作1∶200稀释,是最佳的工作浓度,而且该法特异性高,重复性好,质量稳定,敏感性强,结果可靠,是一种适合于流行病血清学调查的快速、敏感、准确、特异、重复性好的方法。