禽致病性大肠杆菌HlyE蛋白的免疫原性研究

为评估禽致病性大肠杆菌(APEC)溶血素HlyE蛋白的免疫原性,本研究对APEC溶血素HlyE蛋白进行原核表达和纯化,并对表达的重组蛋白进行SDS-PAGE和western blot分析,将纯化蛋白利用透析袋在4℃透析后,利用血琼脂平板对其溶血活性进行检测。SDS-PAGE和western blot结果显示,表达并纯化到分子量约为36 ku的重组HlyE蛋白(rHlyE),经ND-2000超微量核酸蛋白测定仪测定纯化后蛋白浓度为0.65 mg/mL;溶血活性检测结果显示,rHlyE具有溶血活性。以透析后的rHlyE作为抗原,按照50μg/只的剂量免疫小鼠,对照组于相同时间点注射等量PBS,共免疫3次间隔14 d,并于首免后不同时间采血,采用间接ELISA方法检测两组小鼠血清特异性抗体水平,并于三免后18 d以2 LD₅₀的APEC菌液攻毒小鼠,观察7 d内小鼠的死亡情况;于首免后28 d剖杀各组小鼠取其脾脏制备脾淋巴细胞,采用流式细胞术分别检测CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺T淋巴细胞亚型比率,对rHl...     

24味中草药对舌鳎源嗜水气单胞菌的体外抑菌效果

采用水提法提取诃子、知母等24味中草药的有效成分,用琼脂平板打孔法和试管二倍稀释法分别测定这些中草药对舌鳎嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila的抑菌圈和最小抑菌浓度(MIC),以筛选出体外抑菌效果较好的中草药。结果表明,诃子、夏枯草、青皮、苏木4种药物抑菌效果较好,其中诃子、夏枯草的抑菌效果最好,抑菌圈直径平均25mm以上,MIC为31.25mg/mL。本结果为开发中草药相关产品以及防治由嗜水气单胞菌引起的细菌性疾病提供了参考。     

中药对鸡致病性大肠埃希菌的体外抑菌试验

为研究25种中药对秦皇岛地区鸡致病性大肠埃希菌(Escherichia coli)地方流行株QH1(O78)、QH2(O89)、QH4(O1)的体外抑菌效果,以E.coli标准株ATCC25922作为质控菌株。利用水提法制备中药药液,使终浓度为1g/mL;用平板琼脂打孔法和改良微量二倍稀释-平板法分别测定25种中药的抑菌圈直径和最小抑菌浓度(MIC)。结果表明,金银花、黄连、乌梅、五味子4种中药对鸡致病性E.coli地方株极度敏感,抑菌圈直径在20.3mm~22.7mm之间,其MIC在15.65mg/mL~31.25mg/mL之间;其他药物对鸡致病性E.coli地方株有不同程度的敏感性,为鸡致病性E.coli地方株中药防治提供理论基础。     

框镜鲤维氏气单胞菌溶血素基因片段的克隆与序列分析

本试验对维氏气单胞菌的溶血素基因片段进行PCR扩增、测序后分析,结果表明,维氏气单胞菌的溶血素基因片段序列与气单胞菌属的不同菌种的溶血素基因具有很高的同源性;其编码蛋白的二级结构预测:α螺旋与β转角占有很高的比例,可能有4区域形成B细胞表位.     

1株草龟维氏气单胞菌的分离鉴定及药敏谱分析

旨在确定河北昌黎县某花鸟鱼店宠物草龟发病死亡的病因,笔者从发病草龟体内分离纯化出1株优势菌CLW-1,通过解剖观察、细菌分离培养、革兰染色镜检、生化鉴定和16S rDNA基因测序对其分析鉴定,并通过药物敏感性测试检测菌株的耐药性,通过斑马鱼接种试验和毒力基因检测其致病性。结果显示,该菌在血琼脂平板形成湿润、表面光滑、呈β溶血的灰白色菌落,在RS琼脂培养基上长出光滑湿润的黄色菌落;革兰染色镜检为阴性短小球杆菌;16S rDNA基因序列同源性分析表明,分离菌株CLW-1与维氏气单胞菌为同一族,相似性均达99%以上;斑马鱼接种试验结果显示,该菌具有较高的致病力,其LD₅₀为1.26×10⁶CFU;毒力基因扩增结果表明,分离菌株CLW-1具有aerA、Exu、Lip和Ser毒力基因;药敏试验结果显示,分离菌株CLW-1对哌拉西林、头孢唑林和恩诺沙星等敏感;对呋喃唑酮、苯唑西林和红霉素等中敏;对麦迪霉素、克林霉素和万古霉素等耐药。通过试验结果确定此分离菌株CLW-1为维氏气单胞菌,携带毒力基因,具有较高致病力,应用对应的抗生素治疗效果较好,为维氏气单胞菌病的防治奠定基础。     

貉肠炎沙门菌htra基因缺失株的构建及其生物学特性

利用Red同源重组方法对HtrA蛋白编码基因htra进行敲除,并从生长特性、生化特性、耐pH应激与氧化应激、抗血清杀伤和菌株毒力等几方面对突变菌株进行评价。结果显示,与野生型菌株相比,htra基因缺失株生长特性和生化特性无明显差异,但其对酸性和碱性环境的敏感性增加,对血清的耐受力下降;动物试验结果显示,htra基因缺失后肠炎沙门菌对小鼠半数致死量有显著提高。本试验成功构建了貉肠炎沙门菌htra基因缺失株,为研究HtrA蛋白的作用机制奠定了基础。     

禽安卡拉病毒的鉴定和主要结构蛋白基因分子特征分析

安卡拉病毒属禽腺病毒C群Ⅳ血清型,临床上以引起患病鸡心包积液和肝炎为典型病理变化,发病急,死亡快,对养禽业造成巨大的经济损失。2016年5月秦皇岛市昌黎县某养鸡场养殖肉鸡大量死亡,死亡率高达80%,剖检见典型的心包积液、肝脏坏死和肾脏肿大,结合PCR鉴定、鸡胚和雏鸡接种试验,以及电镜观察,证明病原为安卡拉病毒,并命名为FAV-4QHD;通过对病毒主要结构蛋白Hexon、Penton、Fiber1和Fiber2基因测序和构建系统发育树发现,FAV-4QHD与近几年的国内分离株亲缘关系最近,与FAV-4标准株ON1和国外分离株差异较大。研究结果为进一步分析安卡拉病毒毒力增强机制奠定基础。     

肠炎沙门菌icdA基因缺失株的构建及重要特性分析

为研究肠炎沙门菌异柠檬酸脱氢酶(IDH)的功能,本研究利用λ-Red重组技术构建了肠炎沙门菌IDH编码基因icdA缺失突变株c50336ΔicdA,对其进行生长和生化特性检测,并通过体外模拟应激试验、药敏试验、生物被膜检测、抗蛋清杀伤、胞内存活和动物感染实验,分析icdA基因在肠炎沙门菌致病机制中的重要作用。研究结果显示,icdA基因缺失不影响肠炎沙门菌的生长特性和生化特性,在热应激(42℃)、酸应激(pH3.5)和高渗应激(NaCl2.4mol/L)条件下其存活率也未出现显著变化,但icdA基因缺失能够显著降低肠炎沙门菌对碱、低渗透压和过氧化氢应激的抵御能力,降低肠炎沙门菌对多粘菌素B的耐药性和生物被膜的形成能力;同时,该基因缺失能够降低肠炎沙门菌对蛋清杀伤的防御能力、在巨噬细胞内的存活能力和其对小鼠的毒力。研究结果表明icdA基因参与肠炎沙门菌的抗应激能力、耐药性、生物被膜形成和抗蛋清杀伤能力,从而影响细菌的毒力。本研究为肠炎沙门菌疫苗的研究奠定了重要基础。     

1株致水貂败血症粘质沙雷菌的分离鉴定

粘质沙雷菌是一种重要的条件致病菌,多造成医院感染,引起伤口感染、肺炎、脑膜炎和败血症。目前,关于人粘质沙雷菌感染的报道较多,在其他动物上报道较少。本研究从秦皇岛市昌黎县某水貂养殖场患病水貂心血内分离到1株细菌,经过生理生化特性和16S rDNA序列分析,鉴定为粘质沙雷菌,并命名为Sm-1,在国内尚属首次。通过耐药性分析,确定了Sm-1对左氧氟沙星、头孢曲松钠、新诺明高度敏感,为本病的防治提供了理论依据。