猪瘟流行毒株E2基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

用RT-PCR方法扩增了陕西省近期猪瘟流行野毒株E2基因，并将其克隆到pMD18-T载体；经转化、筛选、鉴定后，测定了核苷酸序列，根据C株、Brescia株和Alfort株确定起始氨基酸三联体的正确位置后进行gp55氨基酸序列推导，并进行同源性比较。结果表明，该猪瘟流行毒株的E2核苷酸序列与C株、Brescia株和Alfort株的E2核苷酸序列同源性分别为81．9％、83．4％和83．5％；相应地，gp55氨基酸同源性分别为94．8％、95．6％和95．3％。将此E2基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb后获得了重组质粒pFBHT-E2，进而转化入含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中，发生转座作用；经抗性及蓝白斑筛选得到了含E2基因的重组DNA，将其命名为rBacmid-E2。此研究为进一步在昆虫细胞中表达E2基因、开发研制猪瘟基因工程疫苗奠定了基础。     

伪狂犬病病毒Min-A株糖蛋白gE基因真核表达质粒的构建

根据已发表的PRV－Rice株的gE基因序列设计了一对引物,以PRV－MinA株的DNA为模板,用PCR法特异性地扩增出了PRV Min-A株的gE基因,并克隆到pUC19中,再与杆状病毒转座质粒pFastBacl连接得到pFastBac-gE,pFastBac-gE转化穿梭载体Bacmid,得到了重组rBacmid-gE表达载体。     

1型、2型牛病毒性腹泻病毒通用RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速检测1型、2型牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的通用RT-PCR方法,根据GenBank上收录的64株1型、2型BVDV以及1株猪瘟病毒(CSFV)的全基因组序列,应用Primer 6.0软件设计针对5'-UTR区域的1型、2型BVDV特异性通用引物对,扩增目的片段,并对该方法进行特异性、敏感性、重复性试验及利用该方法开展临床样品检测。结果显示:扩增的目的片段长度约为302 bp;该方法的灵敏度为2.09×102 copies/μL,无非特异性扩增,且重复性良好。对采自山东省发病牛场的13份鼻腔棉拭子和9份牛血清临床样品进行检测,发现有8份鼻腔棉拭子和8份血清为BVDV阳性,随机抽取4份阳性样品送测序,发现3份样品毒株为1型BVDV,1份样品还需进一步鉴定。本研究建立的RT-PCR方法可实现对1型、2型BVDV核酸的特异性检测,也可用于该病的流行病学调查研究。     

猪伪狂犬病毒纳米PCR检测方法的建立

[目的 ]快速灵敏检测猪伪狂犬病毒(PRV)[方法 ]根据PRV g B基因设计特异性引物,建立了PRV纳米PCR检测方法。[结果 ]PRV纳米PCR方法的最低检出限为10拷贝/μL,其敏感性比未添加纳米金的对照PCR提高100倍;建立的纳米PCR与猪细小病毒、猪圆环病毒Ⅱ型、猪繁殖与呼吸综合征病毒等常见猪病毒性病原均无交叉反应。应用纳米PCR和PRV国家标准中的PCR方法,对2014—2016年期间采集自17个省市发病猪场的148份临床样品进行平行检测,PRV纳米PCR的阳性检出率为49.3%(73/148),PRV国标PCR方法的阳性检出率为23.6%(35/148),并且PRV纳米PCR检测为阳性,而PRV国标PCR方法检测为阴性的38份样品,测序结果均确认为PRV阳性。[结论 ]本研究建立的纳米PCR检测方法敏感特异,可用于猪伪狂犬病的病原学检测。     

雏鸡喹乙醇中毒血液生化指标测定

为探讨喹乙醇急性中毒雏鸡血液生化指标的变化情况,。将200只5日龄伊莎公鸡雏随机分为2组,对照组饲喂基础饲粮,试验组饲喂基础饲粮+150mg/kg喹乙醇。在染毒后5、10、15d,对相关血液生化指标进行检测。结果表明,喹乙醇中毒时,在各时间点,试验组血清K+含量均高于对照组,在15d差异显著(P<0.05);试验组血清中Ca2+、PO43-、Na+含量均低于对照组,在15d差异均显著(P<0.05);试验组血清ALB、TP含量均低于对照组,ALB在15d差异显著(P<0.05),TP在10d和15d差异显著(P<0.05);试验组血清ALP、GOT、GPT活性高于对照组,GOT、GPT在15d差异显著(P<0.05)。结果显示喹乙醇中毒能够引起雏鸡相关血液生化指标的改变,喹乙醇有一定的蓄积毒性。     

华东部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查

为了解华东部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株变异情况,本研究以RT-PCR技术对山东、福建发病猪场的41份组织样品进行PRRSV检测和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)相关毒株(HP-PRRSVLike)检测,对阳性样品进行PRRSV分离、ORF5基因测序及变异分析。结果显示,福建、山东样品的阳性率分别为56%、74%;共分离到16个美洲型毒株(福建10株、山东6株),分属于Lineage 8、Lineage 5、Lineage 3、Lineage 1四个谱系,其中以Lineage 8为主。这表明PRRSV流行毒株多样化,跨谱系毒株重组值得警惕。