猪伪狂犬病毒gD蛋白的截短表达与PPA—ELISA抗体检测方法的建立

为建立一种快速的猪伪狂犬病毒抗体检测方法,本研究参照已发表的PRVSA株基因组序列,PCR扩增了长约1070bp的gD基因片段,将目的片段定向克隆到pET30a原核表达载体,转化BL21表达菌,经IPTG诱导后获得了以包涵体形式表达的重组gD蛋白。重组蛋白纯化后,经免疫印迹检测证明具有良好的抗原性和特异性。以该蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白为二抗,建立了检测猪伪狂犬病毒抗体的PPA—ELISA检测方法。该方法与其他7种常见猪病病毒（CSFV、PPV、PRRSV、JEV、PCV－2、PEDV、TGEV）的阳性血清不发生交叉反应;批内重复性试验的变异系数小于5％,批间重复性试验的变异系数小于10％;与IDEXXgD-ELISA试剂盒相比较,符合率、敏感性和特异性分别为92．0％、95．1％和88．1％。本研究建立的PRVgD-PPA—ELISA抗体检测方法具有良好的重复性、敏感性和特异性,为PRV的免疫猪群抗体监测、快速诊断和PRV流行病学调查提供一种快速、简便的血清学诊断方法。     

ARV、REV与ALV三重RT-PCR检测方法的建立

根椐GenBank中已发表的禽呼肠孤病毒（ARV）、禽网状内皮增生病病毒（REV）、禽白血病病毒（ALV）等3种病毒基因组序列,设计了3对分别与ARV、REV和ALV某段基因序列互补的引物。在建立各病毒单项RT-PCR技术的基础上,优化三重RT-PCR反应条件,建立了3种病毒的三重RT-PCR技术。结果表明,用这3对引物对同一样品中的ARV、REV、ALV核酸模板进行三重RT-PCR扩增,可同时扩增ARV的247bp,ALV的675bp,REV的467bp的特异性片段,而对其他6种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该三重RT-PCR技术能检出10pg的ALV、1pg的ARV和10pg的REV模板。用42份临床病料对本研究多重RT-PCR技术和单项RT-PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为92%以上。表明建立的多重RT-PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。     

基于两种动物模型测定猪伪狂犬病病毒LD_（50）与TCID_（50）比较研究

伪狂犬病活疫苗作为一种安全有效、全国广泛推广使用的疫苗,其效力检验十分必要,而伪狂犬强毒毒价测定则是效力检验的一个必要前提。本实验选用BHK-21细胞及家兔和小鼠实验动物,来检测PRV的TCID50和LD50,旨在找出基于家兔和小鼠两种实验动物PRVTCID50和LD50之间的关系,以简化该苗的效力检验过程。结果表明：用兔子做效力检验时,可以用TCID50代替测LD50。     

猪伪狂犬病病毒双基因缺失gI~-/gE~-/PRV SA738灭活疫苗的安全性与免疫效力

在构建gE和gI双基因缺失猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)SA738株的基础上,以绿色荧光蛋白为标志,将gI-/gE-/PRV SA738转染BHK-21细胞,通过蚀斑法得到纯化的gI-/gE-/PRV SA738。毒价检测结果显示,TCID50由7.25下降至5.75,表明该病毒已被弱化,与预期结果相当。将该病毒灭活后,以不同滴度接种无母源抗体仔猪及妊娠母猪,安全性检测表明,gI-/gE-/PRV SA738对仔猪体温、生长,对妊娠母猪产仔及仔猪健康状况均无影响。随后将灭活的gI-/gE-/PRV SA738与弗氏佐剂混合乳化,分别接种家兔与仔猪,免疫后7、14、21、28d采血分离血清。经ELISA检测,家兔免疫后14d、仔猪免疫后7d均显示阳性,对照组均为阴性。抗体中和试验表明,家兔免疫后14d抗体水平比7d显著升高,但至21d,抗体升高不明显;仔猪抗体水平至28d,中和抗体水平达到1∶262.23,与21d相比差异极显著。免疫后28d,采用100LD50PRV强毒攻击动物,进行免疫保护性试验,结果显示,家兔免疫组只有一只出现轻微的一过性临床症状,未出现死亡,而对照组出现了奇...     

基于两种动物模型测定猪伪狂犬病病毒LD50与TCID50比较研究

伪狂犬病活疫苗作为一种安全有效、全国广泛推广使用的疫苗,其效力检验十分必要,而伪狂犬强毒毒价测定则是效力检验的一个必要前提。本实验选用BHK-21细胞及家兔和小鼠实验动物,来检测PRV的TCID50和LD50,旨在找出基于家兔和小鼠两种实验动物PRVTCID50和LD50之间的关系,以简化该苗的效力检验过程。结果表明:用兔子做效力检验时,可以用TCID50代替测LD50。     

猪伪狂犬病病毒双基因缺失gI^-／gE^-／PRV SA738灭活疫苗的安全性与免疫效力

在构建gE和gI双基因缺失猪伪狂犬病毒（Pseudorabiesvirus,PRV）SA738株的基础上,以绿色荧光蛋白为标志,将gI^-／gE^-／PRVSA738转柒BHK-21细胞,通过蚀斑法得到纯化的gI^-／gE^-／PRVSA738。毒价检测结果显示,TCID50由7．25下降至5．75,表明该病毒已被弱化,与预期结果相当。将该病毒灭活后,以不同滴度接种无母源抗体仔猪及妊娠母猪,安全性检测表明,gI^-／gE^-／PRVSA738对仔猪体温、生长,对妊娠母猪产仔及仔猪健康状况均无影响。随后将灭活的gI^-／gE^-／PRVSA738与弗氏佐剂混合乳化,分别接种家兔与仔猪,免疫后7、14、21、28d采血分离血清。经ELISA检测,家兔免疫后14d、仔猪免疫后7d均显示阳性,对照组均为阴性。抗体中和试验表明,家免免疫后14d抗体水平比7d显著升高,但至21d,抗体升高不明显;仔猪抗体水平至28d,中和抗体水平达到1：262．23,与21d相比差异极显著。免疫后28d,采用100LD50 PRV强毒攻击动物,进行免疫保护性试验,结果显示,家兔免疫组只有一只出现轻微的一过性临床症状,未出现死亡,而对照组出现了奇痒等较重的临床症状,且于5d后全部死亡;仔猪对照组攻毒后2d,出现了精神高度沉郁、不食、呕吐与腹泻等症状,并于5d后死亡;免疫组攻毒后3d,出现轻微食欲不振、精神萎靡、腹泻等症状,且于攻毒后6d恢复正常,免疫保护率为100％。以上结果表明,该gI^-／gE^-／PRVSA738-突变株有效诱导了机体的保护性免疫应答。     

鲁北地区全株玉米青贮饲料霉菌毒素检测分析

为了评估鲁北地区全株玉米青贮饲料霉菌毒素含量及危害情况,在鲁北地区18家养殖场青贮池中采集青贮样品,利用ELISA检测方法,开展了呕吐毒素(DON)、黄曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、T-2、赭曲霉毒素(OTA)等5种常见霉菌毒素的检测分析。结果表明:呕吐毒素、T-2毒素检出率均为100%,黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素检出率分别为55.56%、27.78%、5.56%;5.56%的样品存在黄曲霉毒素B1超出限量标准,其他均在限量标准以下。添加乳酸菌制剂制备组的呕吐毒素、黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮3种霉菌毒素平均含量明显低于未添加组。全部样品中均检测出2种以上霉菌毒素,其中DON+T-2+AFB1三种霉菌毒素的组合检出率最高,达到38.89%,因此需提高对全株玉米青贮饲料霉菌毒素污染的认识和重视程度。