Real-time PCR技术用于中国大菱鲆虹彩病毒的组织敏感性检测及病毒流行情况调查

中国大菱鲆虹彩病毒(turbot reddish body iridovirus, TRBIV)是一种感染养殖大菱鲆的鱼类虹彩病毒,它可以引起大菱鲆病毒性红体病并导致养殖大菱鲆大量死亡。本研究利用TRBIV主要衣壳蛋白基因序列设计的一对引物,结合内嵌式核酸染料SYBR Green І,建立了TRBIV特异的Real-time PCR检测方法。实验结果表明,该对引物具有较高的灵敏度和较强的特异性,能够检测相当于102数量级的TRBIV基因组拷贝,而不与健康大菱鲆组织DNA、淋巴囊肿病毒DNA发生交叉反应。最后,应用建立的Real-time PCR检测方法,开展了TRBIV的组织敏感性检测和病毒流行情况调查。结果发现,大菱鲆的脾脏、肾脏、脑、鳃、心脏、肝脏、消化道、血液等组织中均可检测到TRBIV的存在,其中脾和肾是TRBIV的最主要的靶器官,每毫克组织的病毒含量分别高达5.23106个和2.18106个。分子流行病学调查结果显示,在山东半岛的多个大菱鲆养殖场中均存在TRBIV的感染和流行。     

斑石鲷卵鞭虫病病原的分子鉴定与系统发育分析

[目的]对严重危害斑石鲷鱼苗的卵鞭虫病病原——渤海分离株(Bohai-1407 isolate)进行分子生物学鉴定和系统发育分析。[方法]设计4对特异性引物,应用PCR方法克隆并测定渤海分离株的核糖体DNA(rDNA)序列;应用Blast比对分析渤海分离株rDNA的结构;依据rDNA序列,分别构建10种胚沟科鞭毛虫和19株眼点淀粉卵涡鞭虫分离株/克隆的系统发育树,分析渤海分离株的系统分类地位。[结果]扩增出了渤海分离株的4个DNA片段,拼接出长度为6 530 bp的r DNA操纵子序列;该操纵子由74 bp的部分外转录间隔区(ETS)、1 813 bp的小亚基(SSU)、352 bp的内转录间隔区1(ITS1)、159 bp的5.8S、698 bp的内转录间隔区2(ITS2)和3 388 bp的大亚基(LSU)串联而成,3'端还有46 bp的部分非转录间隔区(NTS);渤海分离株与眼点淀粉卵涡鞭虫宁德株(Ningde1412)的rDNA序列相似性高达99.5%;依据SSU序列建立了包含10种胚沟科鞭毛虫的系统发育树,渤海分离株与世界各地分离到的眼点淀粉卵涡鞭虫聚类在一起,将其鉴定为眼点淀粉卵涡鞭虫;依据ITS1和ITS2序列建立了包含19株眼点淀粉卵涡鞭虫的2个系统发育树,渤海分离株与从美国弗罗里达盐水池塘中分离到的墨西哥湾分离株FL_21(DQ490260.1)总是聚类在一起。[结论]斑石鲷卵鞭虫病的病原——渤海分离株可以鉴定为眼点淀粉卵涡鞭虫,该分离株与墨西哥湾分离株FL_21的亲缘关系最近。     

致病性假交替单胞菌的分离鉴定及药敏特性研究

[目的]分离鉴定患病的七带石斑鱼（Epinephelus septemfasciatus Thunberg）的致病菌,并研究其药敏特性。[方法]从患病的七带石斑鱼体内分离出1株致病菌BY0081。通过ATB微生物鉴定系统和菌体常规形态特征、生理生化反应指标测定以及16S rDNA测序分析等进行综合鉴定;通过人工感染水生模式动物剑尾鱼测定该菌株对其的半数致死量（LD50）;最后进行药敏试验确定其药敏特性。[结果]致病菌BY0081为革兰氏阴性菌,菌落呈米色,边缘光滑,中间略有隆起,为假交替单胞菌（Pseudoa lteromonas sp.）。其在较低的温度下仍有较强的毒力,其对水生模式动物剑尾鱼（Xiphophorus helleri）的LD50为2.82×105cfu/g鱼体重。该菌对菌必治、复方新诺明、氯霉素和氟哌酸等抗生素高度敏感,对复达欣、红霉素、丁胺卡那霉素和庆大霉素等药物中度敏感。[结论]该研究对防治由假交替单胞菌引起的鱼类疾病有积极意义。     

常温核酸探针点杂交法检测对虾白斑综合征病毒的PCR扩增产物

聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术和核酸探针杂交技术已成为十分重要的病原检测手段,在对虾白斑综合征病毒(white spotsyndrome virus,WSSV)的检测中,已得到广泛的应用[1～3].     

同步检测海水养殖动物5种病原菌的扩增子拯救多重PCR(Arm-PCR)方法的建立与应用

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、哈维氏弧菌(V.harveyi)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)和副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)是我国海水养殖动物5种重要的病原菌.本研究在分析了其致病因子基因的基础上,依据扩增子拯救多重PCR(Arm-PCR)的原理,设计了5套特异性的套式PCR引物,并在各内引物的5'端分别加上能被一对通用引物识别的标签序列;通过对套式PCR中影响扩增结果的引物混合物浓度、退火温度、Mg2+浓度、dNTPs浓度以及Taq DNA聚合酶浓度等5个反应参数的调整和优化,最终建立了一种能同步检测海水养殖动物5种常见病原菌的Arm-PCR方法.优化后的Arm-PCR方法第一步PCR反应体系为:10×PCR Buffer 5 μL(含20 mmol/L的Mg2+),dNTP(各2.5mmol/L)5μL,T的酶(2.5 U/μL)0.6 μL,10×Primer Mix(2 μmol/L)5 μL,DNA模板各1μL,灭菌双蒸馏水补足至50 μL,反应的退火温度为55℃.实验结果表明:对鳗弧菌、哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌和副溶血弧菌这5种病原菌,使用该方法可以在1支反应管内快速、同步进行检测,得到大小分别为144、190、266、315和371 bp的特异性产物,其检出灵敏度分别为1.745、1.847、16.000、28.126和369.900 pg细菌基因组DNA;该方法特异性强,与大肠杆菌(Escherichia coli)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、河豚毒素假交替单胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等其他细菌以及半滑舌鳎基因组DNA不产生交叉反应.2012年,应用该Arm-PCR方法对分离自病鱼的24个优势菌株进行了检测,确定出5株迟缓爱德华氏菌、3株嗜水气单胞菌、2株哈维氏弧菌及2株副溶血弧菌,证实该方法具有良好的可靠性和实用性.该方法不仅适用于海水养殖动物中致病性鳗弧菌、哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、副溶血弧菌的快速、同步检测和病原流行情况调查,也为进一步开发相应的基因芯片检测方法打下了基础.     

锦鲤摩氏摩根氏菌的分离鉴定与药敏性研究

为鉴定2009年山东某养殖场锦鲤病病原,本研究从病鱼体内分离到3株优势菌,经回归感染实验证实编号为A400502的分离株为该病的致病菌.该菌为革兰氏阴性杆菌,周生鞭毛,大小为0.5 μm～0.7 μm×1.0 μm～1.5 μm.其生化特征为鸟氨酸脱羧酶、尿素酶、酚红反应阳性,赖氨酸脱羧酶和精氨酸双水解酶阴性.利用16S rDNA序列分析和比对结果构建的系统发育树表明,该菌与登录号为EF455493的摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)的同源性高达99％,因此将该菌鉴定为摩氏摩根氏菌.26种药物的敏感实验结果表明,该分离株对复达欣、庆大霉素、新霉素等11种药物高度敏感.     

鱼类细胞肿大虹彩病毒病研究进展

鱼类细胞肿大虹彩病毒病在东亚和东南亚的真鲷、石斑鱼、大菱鲆、大黄鱼、鳜鱼等多种养殖鱼类中的频繁流行,致使感染鱼类出现大面积死亡,已成为危害养殖鱼类最严重的病毒病之一.文章综述了近年来鱼类细胞肿大虹彩病毒病的研究现状,重点介绍了该类疾病的流行病学、临床症状、组织病理学、分子生物学检测技术、病毒的传播途径、致病机制以及病毒的免疫防控等方面的研究进展,并对当前鱼类细胞肿大虹彩病毒研究中存在的问题进行了分析和展望.     

鱼类抗病毒非特异性免疫机制研究进展

鱼类抗病毒非特异性免疫系统主要包括自然杀伤细胞、单核巨噬细胞系统及干扰素,蛋白因子白介素、趋化因子、肿瘤坏死因子及干扰素诱导产生的蛋白激酶PKR、Mx蛋白、主要组织相容性蛋白、一氧化氮合成酶在鱼类抗病毒免疫中发挥重要的作用。了解病毒与鱼体之间的相互作用机理,为鱼类病毒性疾病防控奠定基础。