小反刍兽疫病毒间接ELISA抗体检测方法的建立与初步应用

本研究利用原核表达的小反刍兽疫病毒核衣壳（N）蛋白作为标准抗原蛋白,建立PPRV抗体检测方法,同时对建立的检测方法的相关条件进行了优化。通过优化确定抗原的最佳包被浓度为10 mg/L,血清最佳稀释度为1∶40,二抗的使用浓度为1∶200,血清及二抗的最佳反应条件为37 ℃孵育60 min,底物的最佳反应时间为37 ℃ 15 min。通过批内及批间重复性的评价,变异系数均小于0.1,表明本检测方法具有较高的可重复性。经过临床样品检测证明,建立的检测方法可用于临床PPRV抗体的检测。     

西尼罗病毒E蛋白结构域Ⅲ在昆虫S2细胞中的表达与鉴定

根据GenBank中发表的西尼罗病毒(WNV)E domainⅢ基因序列设计1对引物,用PCR方法扩增domainⅢ基因片段,回收目的基因片段定向克隆入果蝇表达载体pMT/B/V5,构建重组表达载体pMT-DⅢ。测序验证正确后,用脂质体转染法与辅助质粒pCoBlast共转染果蝇S2细胞,通过Blasticidin进行加压筛选,获得了抗性细胞S2-DⅢ。提取S2-DⅢ细胞的基因组DNA,用PCR方法检测目的基因在果蝇S2细胞中的整合与表达。用硫酸铜溶液诱导表达,收集无血清的细胞表达上清,样品浓缩后进行SDS-PAGE及Western blotting鉴定。结果表明,研究成功构建了重组表达载体pMT-DⅢ,转染细胞经12mg/L的Blasticidin筛选及鉴定后获得了稳定表达WNV E do-mainⅢ蛋白的果蝇S2细胞株。     

犬瘟热病毒截短P蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为制备针对犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)P1蛋白的单克隆抗体(McAb),本研究利用重组犬瘟热病毒P1蛋白免疫BALB/c小鼠,并将其脾淋巴细胞与SP2/0进行融合,用CDV包被ELISA板,通过间接ELISA法筛选出两株稳定分泌抗CDV-P1的杂交瘤细胞株(E9E4C10、E9F8D9)。间接ELISA检测腹水效价均为1∶10⁶,亚类鉴定结果均为IgG2b。Western blotting和间接免疫荧光(IFA)分析结果表明,两株单克隆抗体均能与重组P1蛋白和CDV发生反应;ELISA叠加试验增殖结果表明,两株单克隆抗体识别的抗原表位不同。本研究制备的特异性抗CDV-P1的单克隆抗体为建立CDV免疫学检测方法和P蛋白的功能研究奠定了基础。     

犬细小病毒北京分离株VP2基因的表达与抗原性分析

本研究基于犬细小病毒(canine parvovirus, CPV) VP2基因序列设计引物,利用PCR技术扩增该基因。扩增的VP2基因连入表达载体pET-32a(＋),经PCR及双酶切鉴定基因连入正确。重组表达载体转入大肠杆菌后,经IPTG诱导,SDS-PAGE及Western blotting分析表明有特异蛋白的表达,分子质量大小为87 ku。将表达的蛋白包被酶标板后用抗犬细小病毒单抗与其反应,表明表达的VP2蛋白可以与相应抗体特异结合。     

血液代用品样品中牛白血病病毒的检测

牛白血病是由牛白血病病毒（bovine leukemia virus,BLV）引起的牛的一种慢性肿瘤性疾病。其特征为淋巴样细胞恶性增生,进行性恶病质和发病后的高死亡率。此病早在19世纪末就被发现,但直到1969年才由美国的Miller从病牛外周血液淋巴细胞中分离到病毒。目前此病几乎遍及全世界各养牛国家,亚洲的日本发生也较多。此病在我国于1974年首次发现于上海,目前本病有逐渐扩大蔓延的趋势。在某些牛群中血清阳性率已达30％～50％,已成为牛的重要传染病之一。牛源的血液代用品是生物医学研究的重要方向,具有广阔的应用前景,所以此类代用品病毒安全性检测就日益受到关注。     

犬细小病毒生物学特征及检测技术研究进展

犬细小病毒(CPV)所引起的疾病在世界范围内流行,临床主要表现为犬的肠炎和心肌炎。CPV属于单股负链的自主复制的细小病毒属成员,其基因组可编码两种结构蛋白和两种非结构蛋白。CPV的主要检测方法有分子生物学检测方法和免疫学检测方法,其中分子生物学检测方法包括常用的PCR检测技术、核酸杂交检测技术及近年发展起来的LAMP检测技术及NASBA检测技术。免疫学检测方法主要包括ELISA检测技术、胶体金检测技术、血凝试验、免疫荧光检测技术及未来可用于CPV检测的生物条形码检测技术。新技术的应用必将为临床控制CPV找到更为有效的检测方法。     

快速检测小反刍兽疫病毒RT—LAMP方法的建立

本研究采用一步法反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)建立了一种快速、灵敏、高度特异的检测小反刍兽疫病毒(PPRV)的方法.针对PPRV-N基因保守区域设计4条引物,在Bst大片段聚合酶的作用下,可以实现DNA的梯状等温扩增.优化RT-LAMP的反应体系,并检验其灵敏性、特异性.一步法RT-LAMP检测方法从核酸抽提到检测结果出现仅需70 min,该方法具有良好的特异性,与同属的犬瘟热病毒无交叉反应,灵敏度是RT-PCR的1 000倍,是巢式RT-PCR的100倍.结果证明,RT-LAMP方法可快速、灵敏、特异、经济地检测PPRV,在基层和实验室都具有良好的应用前景.     

克伦特罗单克隆抗体的制备及其初步鉴定

【研究目的】制备克伦特罗单克隆抗体（McAb）,为建立克伦特罗残留检测方法奠定基础。【方法】用偶氮化法将克伦特罗与钥孔血蓝蛋白（KLH）、牛血清白蛋白（BSA）及卵清白蛋白（OVA）偶联,制备完全抗原,免疫Balb/c小鼠,建立杂交瘤细胞株以制备单抗,并对单抗的特异性、交叉反应性及抗原识别位点等特性进行了初步鉴定。【结果】获得了1H5、1H7、1D6、2F10四株杂交瘤腹水效价均在1：105以上。对沙丁胺醇交叉反应性测定,最小的是1D6,只有2.32%的交叉反应性。单抗相对亲和力1D6〉1H5〉1H7〉2F10。抗原识别位点分析结果表明,这四株单抗至少识别两个不同的抗原位点。选用1D6初步建立了竞争ELISA检测方法,检测限可达1ng/ml,为进一步研制残留检测试剂盒奠定了基础。     

含大麻叶提取物的润唇喱的制备

提供一种工业化清洁方法制备含大麻叶提取物的润唇啫喱。工业大麻花叶预处理及干燥,乙醇提取后真空减压浓缩、超低温脱脂脱蜡、脱色后,分子蒸馏,得到含量25%~35%的大麻二酚(Cannabidiol,CBD)全谱油。通过工业制备高效液相色谱系统精准分离,先用40%~60%的乙醇溶液平衡,再用50%~85%乙醇溶液洗脱5~10倍柱体积,然后再用50%~85%的乙醇溶液洗脱5~10倍柱体积洗脱目标成分,收集富含目标成分的洗脱液,得到CBD组分富集液;根据洗脱液中CBD图谱,准确把前杂、CBD组分富集液切到不同的储罐,得到CBD组分富集液。真空减压浓缩后,得到CBD含量为40%~80%的精制CBD广谱油。然后用甘油稀释,使其CBD含量稀释至20%~50%备用。按原料配比称量各项原料。将A相原料投入真空乳化锅,加热溶解至透明,降温后,投入B相原料,搅拌5 min后呈油状啫喱状态,最后降温灌装。结果表明,该方法所制备得含大麻叶提取物的润唇啫喱稳定性良好,卫生指标符合相关规定;使用舒适、保湿、防干裂,淡化唇纹效果良好。该方法可成功制备含大麻叶提取物的润唇啫喱,方法简单,适合工业化大规模生产。     

检测猪圆环病毒2型抗体SPA胶体金免疫层析方法的建立

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,并将其标记SPA,将金标SPA包被至玻璃纤维膜上,将猪圆环病毒2型（PCV-2） Cap蛋白、抗SPA抗体分别包被至硝酸纤维素膜的检测线与质控线上,建立了一种检测PCV-2抗体的胶体金免疫层析方法。检测阳性样品时,在检测线和质控线处均出现红色条带;检测阴性样品时,仅在质控线处出现红色条带。该方法与ELISA相比,其灵敏度为89.19%,特异性为100%,并且与PCV-1、猪瘟病毒（HCV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV）阳性血清无交叉反应。