肾型鸡传染性支气管炎病毒的分离与鉴定

从我省某鸡场有一过性呼吸道症状及剖检肾肿的病鸡中分离到一株病毒，该病毒接种易感鸡可在２４～４８小时出现呼吸道症状，病鸡多数肾肿大、苍白，可致死部分鸡胚和产生侏儒胚，能在鸡胚中干扰鸡新城疫病毒ＬａＳｏｔａ株的生长，但不能凝集鸡红细胞．电镜观察见直径约１３０ｎｍ的圆形颗粒病毒。初步鉴定分离株是鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）。     

DEV囊膜糖蛋白gI基因缺失病毒生物学特性研究

在构建鸭瘟病毒疫苗株细菌人工染色体感染性克隆pDEV-vac的基础上,通过两步Red E/T重组,构建了gI基因缺失的pDEV-ΔgI突变体克隆,并转染鸡胚成纤维细胞获得了重组病毒rDEV-ΔgI。病毒生长曲线显示,rDEV-ΔgI的滴度从12 h到60 h稳步增加,在此期间gI基因缺失毒株病毒滴度较亲本毒株稍有降低,但病毒滴度于72 h接近并超过对照毒株。蚀斑面积测定发现rDEV-ΔgI较亲本毒rDEV-BAC增加约60%。动物实验表明,rDEV-ΔgI注射组对强毒攻击的保护率较对照组下降40%。研究表明:gI为DEV的非必需基因,且gI基因与病毒扩散、免疫保护能力等相关。     

番鸭呼肠孤病毒通用RT-PCR检测方法的建立

根据经典和新型水禽呼肠孤病毒σA基因的保守序列设计一对PCR引物,通过优化病毒RNA提取方法和PCR条件,建立了番鸭呼肠孤病毒通用RT-PCR检测方法。该方法可自1株经典型或4株新型水禽呼肠孤病毒特异性扩增出436 bp条带,其最低病毒检出量为3.6 TCID50,而对鸭甲肝病毒、鸭瘟病毒、新城疫病毒、坦布苏病毒、番鸭细小病毒、产蛋下降综合征病毒和H9N2亚型禽流感病毒扩增均为阴性。对2011~2012采集的224份(番鸭74、鹅68、鸭82)疑似临床病料进行检测,结果 56份为阳性,番鸭、鸭和鹅阳性率分别为59.5%(44/74),11.0%(9/82)和4.4%(3/68),表明水禽呼肠孤病毒主要在番鸭中流行。     

兔病毒性出血症病毒次要结构蛋白（VP2）的表达和细胞内定位分析

病毒蛋白VP2是兔出血症病毒（Rabbit Hemorrhagic Disease Virus,RHDV）的一种次要结构蛋白。本文旨在构建VP2与绿色荧光蛋白融合的真核表达载体,进而利用它研究VP2在细胞内的定位情况。首先在大肠杆菌中表达GST-VP2融合蛋白,然后用纯化的重组蛋白免疫小鼠制备抗VP2的抗血清。对制备的抗VP2抗血清进行特异性分析,再利用该抗体对转染pEGFP-VP2的BHK-21细胞进行检测,以研究VP2蛋白在细胞内的定位情况。结果表明,pEGFP-VP2转染BHK-21细胞后,不仅VP2蛋白得到了成功表达,而且通过检测偶联的绿色荧光蛋白可判断出VP2蛋白主要分布于BHK-21细胞的细胞质。本研究成功构建了VP2与绿色荧光蛋白融合的表达载体,并在真核细胞内实现了表达,通过检测荧光蛋白,发现VP2主要在细胞质内表达并分布,为深入探讨VP2的生物学功能奠定了基础。     

高HI抗体鸡群爆发新城疫的诊断

鸡新城疫ND是危害养鸡业最严重的病毒性传染病之一，目前尽管采用疫苗预防接种，但由于疫苗种类、免疫方法、免疫时间及鸡群免疫状况不同，鸡群虽经多次免疫接种，有些甚至处于高抗体状态，但仍时有爆发ND。我省某鸡场的依莎产蛋鸡，NDHI抗体水平高达1∶128～1∶1028，但仍发生ND，我们从该鸡场病死鸡中分离到一株NDV，经毒力测定，为一株强毒力型病毒，现报道如下。一、材料与方法一材料1．试验鸡：来航鸡为我室非免疫鸡群产蛋孵化后隔离饲养的未免疫雏鸡。2．鸡胚：我室未免疫鸡群所产蛋孵化鸡胚。3．血清学检查试剂由本…     

IBD组织油佐剂灭活苗的安全,效力及致病性试验

ＩＢＤ组织油佐剂灭活苗的安全、效力及致病性试验顾亚仙徐辉梁华丽华炯钢王毅锋丁志成（浙江省农科院病毒室杭州３１００４８）（建德市农业局）（杭州市拱墅区农业局）鸡传染性法氏囊病（以下简称ＩＢＤ）是鸡的一种急性、高度接触性传染病。该病毒主要侵害中枢免疫器官...     

雏鸡新城疫免疫程序的实验观察

鸡新城疫 (ND)的预防 ,目前广泛应用弱毒苗免疫 ,但其免疫效果往往受雏鸡母源抗体影响 [1] ,雏鸡首免日龄过早 ,往往因母源抗体水平过高而影响免疫效果 ,若雏鸡首免日龄过迟 ,严重污染场可能已发病 ,加上母源抗体参差不齐 ,给制订免疫程序带来了不少困难 ;而灭能苗具有安全、无毒力、不受母源抗体影响[2 ] 。为了探索雏鸡免疫程序 ,寻找能够抵抗早期 ND强毒攻击且不受母源抗体干扰的免疫程序 ,我们进行了试验观察 ,报告如下。1　材料与方法1 .1　试验鸡　江村黄鸡 ,购自杭州××鸡场 ;来航鸡 ,本组非免疫鸡群产蛋孵化后隔离饲养。1 .2　 N…     

新型番鸭呼肠孤病毒σC蛋白的原核表达及其抗原特性

新型番鸭呼肠孤病毒是近年来新发现的一种引起鸭严重疾病的病原,该病毒与经典MDRV主要在病毒宿主范围、体外培养特性、临床致病性和免疫保护特性上存在显著的差异。通过RT\|PCR扩增新型呼肠孤病毒σC基因,经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切处理,插入到pET\|28a（+）原核表达载体,获得重组质粒pET\|28a（+）\|σC。将重组阳性质粒转化至BL21（DE3）感受态细胞,诱导表达后经SDS\|PAGE电泳对σC蛋白进行初步分析,蛋白分子量约为36 kDa。重组蛋白经纯化后免疫实验兔,获得抗σC蛋白的高效免疫血清。通过Western Blot与间接免疫荧光实验初步表明,新型鸭呼肠孤病毒σC蛋白具有良好的反应活性。     

表达小鹅瘟病毒VP2蛋白重组鸭瘟病毒的构建及其生物学特性

【目的】鸭瘟和小鹅瘟是番鸭和鹅的两种重要传染病,鸭瘟最主要的防治措施是定期接种鸭瘟病毒减毒活疫苗。根据2012年国际病毒分类委员会（ICTV）的报告,DEV被归为疱疹病毒科的α疱疹病毒亚科马立克氏病毒属。疱疹病毒如伪狂犬病毒、马立克氏病毒、火鸡疱疹病毒等已广泛用于病毒活载体的研究,而近几年也有关于鸭瘟病毒（DEV）作为疫苗活载体的报道。为了为免疫防控鸭瘟和小鹅瘟提供新手段,本研究拟在鸭瘟病毒疫苗株感染性克隆的基础上,构建表达小鹅瘟病毒（GPV）主要免疫原蛋白VP2的重组病毒rDEV-VP2,并研究其生物学特性,进而探讨重组病毒rDEV-VP2作为防治DEV和GPV的二联重组活载体疫苗的可能性。【方法】将密码子优化的GPV VP2基因通过常规基因克隆的方法插入转移载体pEP-BGH-end,构建含有GPV VP2表达框pCMV-VP2-BGH-pA的重组表达质粒。在鸭瘟病毒（DEV）疫苗株细菌人工染色体克隆pDEV-EF1的基础上,通过“Red E/T”两步重组法将GPV VP2基因表达框插入到DEV US7和US8基因之间构建了突变体克隆pDEV-VP2。利用磷酸钙法转染鸡胚成纤维细胞（CEFs）拯救获得重组病毒rDEV-VP2和删除Bac质粒序列的rDEV-VP2-Cre,并对重组病毒细胞体外生长曲线、蚀斑大小和VP2蛋白表达情况进行测定。将rDEV-VP2接种番鸭,在不同时间采集血清,采用间接ELISA法检测血清中GPV VP2抗体产生情况。【结果】间接免疫荧光检测和Western blotting分析表明,外源蛋白VP2在CEFs细胞成功表达。病毒生长曲线和蚀斑大小测定结果显示,rDEV-VP2在CEFs细胞上的增殖滴度与亲本株相比无显著差异,表明外源基因VP2的插入不影响rDEV重组病毒的增殖。动物试验结果表明,7日龄雏番鸭接种rDEV-VP2可以诱导产生针对GPV VP2的抗体,免疫后3周抗体阳性率为50%（4/8）。【结论】本实验将小鹅瘟病毒的主要免疫原基因VP2插入到DEV疫苗株基因组的US7和US8基因间构建了表达该免疫原性基因的重组鸭瘟病毒细菌人工染色体,继而在鸡胚成纤维细胞（CEFs）上拯救获得了重组病毒rDEV-VP2,病毒细胞生长特性与亲本株基本一致,且能诱导鸭体产生GPV VP2特异性的抗体。该研究为研制DEV-GPV二联重组活载体疫苗奠定了基础。     

重组鸭瘟病毒载体中筛选高效表达鸭坦布苏病毒E蛋白启动子

【背景】鸭瘟和鸭坦布苏病毒是鸭的两种重要传染病,鸭瘟属于疱疹病毒科,具有开发成病毒载体的优势。为了优化鸭坦布苏病毒E基因在重组鸭瘟病毒载体中的表达,之前探讨了不同形式鸭坦布苏病毒E蛋白在重组鸭瘟病毒载体中的表达,发现以鸭为宿主进行密码子优化的E基因C端截短形式（E451-dk,简称为Es）表达量最高。【目的】探讨不同启动子对Es 在重组鸭瘟病毒载体中表达的影响,为鸭瘟病毒—坦布苏病毒二联苗的研制奠定基础。【方法】将pCAG、 pSV40、pRSV、p1.8k(MDV)和pgB(MDV)启动子通过常规基因克隆的方法替换转移载体pEP-BGH-Es中的pCMV启动子,构建不同启动子调控Es表达的重组表达框pro-Es-BGH-pA。在鸭瘟病毒（DEV）疫苗株细菌人工染色体克隆pDEV-EF1的基础上,将5个重组表达框分别通过“Red E/T两步重组”克隆至pDEV-EF1突变体的US7和US8基因之间,构建了携带不同启动子调控的Es突变体克隆pDEV-pro-Es。用磷酸钙法转染鸡胚成纤维细胞（CEFs）拯救获得相应重组病毒rDEV-pro-Es,并对重组病毒感染细胞蚀斑大小和Es蛋白表达情况进行测定。【结果】将重组突变体克隆转染细胞拯救获得了5株重组病毒rDEV-pro-Es。Western blotting分析表明外源蛋白Es在 pRSV调控下表达量最高,其表达量较rDEV-Es提高了169.12%。【结论】完成了Es在重组鸭瘟病毒载体中高效表达启动子的筛选,获得了一种调控Es高效表达的启动子pRSV。同时也获得了一株高效表达鸭坦布苏病毒外源基因Es的重组鸭瘟病毒rDEV-pRSV-Es。