猪胸膜肺炎放线杆菌毒素蛋白的表达、纯化及其间接ELISA检测方法的建立与应用

将含有猪胸膜肺炎放线杆菌毒素 基因的质粒 p ET- Apx 转化到大肠杆菌 BL2 1 (DE3)。挑选出表达量最高的克隆子 ,于 37℃经 IPTG诱导表达。对表达条件进行优化 ,并对包涵体进行了提纯和复性。用复性后的蛋白作抗原 ,建立了检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗体的间接 EL ISA。试验的最佳反应条件为 :最佳抗原稀释度为 1∶ 1 6 0 ,抗原包被液用 Tris- HCl(p H8.0 ) ,封闭液用含 0 .4 %BSA的 PBST,血清稀释度为 1∶ 4 0 ,二抗稀释度为 1∶ 6 0 0 0 ,稀释液用含0 .4 %BSA的 PBST,血清反应时间为 30 min,二抗反应时间为 4 5 min,底物反应时间为 2 0 m in。与间接血凝 (IHA)检测结果比较 ,建立的 EL ISA诊断方法具有良好的稳定性和可重复性 ,并具有较高的特异性和敏感性。用建立的间接EL ISA对 2 5 0 3份临床送检血清进行了血清流行病学调查 ,结果表明 ,胸膜肺炎放线杆菌抗体的阳性率为 6 3%。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3B基因的克隆表达及3B-ELISA鉴别诊断方法的初步建立

从口蹄疫病毒（foot—and—mouth disease virus，FMDV）细胞培养物中提取总RNA，经一步法RT—PCR获得了长约230bp的3B基因片段，将PCR产物连接到pMD-18T载体上并测序，用BamH Ⅰ与Hind Ⅲ双酶切后，将3B基因融合到pGEX—KG载体上形成表达质粒pGEX—KG—3B，转化到BL21（DE3）中在27C诱导表达，将表达产物进行SDS—PAGE和蛋白质斑点ELISA。结果表明3B基因主要以可溶形式高效表达，表达产物具有免疫原性。以纯化的表达产物为抗原建立了间接酶联免疫吸附试验（I-ELISA）。方阵滴定其最佳包被浓度是6．1μg／孔，最佳血清稀释倍数为1：80，通过测定36份FMDV阴性血清，确定了该方法的阳性判定标准。结果表明，该方法特异性强、重复性好；用3B—ELISA方法与美国联合生物医学公司（UBI）生产的合成肽检测试剂盒UBI FMDV NS-ELISA对比检测44份血清样品，符合率为93．1％。证明3B—ELISA方法可用于口蹄疫的鉴别诊断。     

检测伪狂犬病病毒双抗体夹心间接ELISA方法的建立与应用

以猪伪狂犬病病毒（PrV）Ea株特异性单克隆抗体576株为捕获抗体，纯化的抗PrV IgG为检测抗体，建立了检测PrV抗原的双抗体夹心ELISA方法。最佳反应条件为，单克隆抗体576株的包被浓度为12．2μg／mL，IgG的工作浓度为16．0μg／mL，对PrV的检测灵敏度达15．6ng（0．156μg／mL），与乙型脑炎病毒（JEV）、猪瘟病毒（HCV）、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV）和猪流感病毒（SIV）等无交叉反应。批间和批内变异系数较小，分别为6．39％和4．1％。应用本方法对人工感染PrV的40日龄仔猪组织进行检测，肺和脑PrV抗原检出率最高，其次是脾、心、肝和肌肉。应用该方法和PrV对159份临床样本进行平行检测，发现二者的符合率可达到77．4％，比PCR敏感。实验结果表明：双抗体夹心间接ELISA方法具有敏感性高、特异性强和重复性好的特点，可广泛应用于动物组织中PrV的检测。     

猪圆环病毒研究进展

圆环病毒是近年来兽医界广泛关注的新发现畜禽类病毒之一,具有重要的经济意义。在2000年墨尔本国际猪病会议(IPVS)和1999年北京国际禽病会议(ICEVP)上均成为受到重视的热门话题。圆环病毒除引起畜禽机体发生原发感染甚至死亡之外,更重要的是使感染畜禽的免疫功能受到损害,结果导致机体抵抗力下降,易遭受其它病原的并发或继发感染,使病情加重,造成更大损失。这种可导致免疫抑制的病毒,由于常以亚临床感染的形式出现,常易为我们所忽视,     

伪狂犬病病毒鄂A株TK-/gE-/gI-基因缺失疫苗的安全性和保护力研究

对PrV Ea TK^-/gE^-/gI^-基因缺失疫苗的安全性和保护力进行了系统的研究。试验表明，该基因缺失疫苗10^5.0TCID50和10^6.0TCID50病毒剂量对妊娠母猪、新生仔猪和育肥猪均是安全的，并可保护妊娠母猪抵抗10^7.1 TCID50强毒的攻击。新生仔猪免疫30d后，gE鉴刖ELISA试验表明，PrV Ea TK^-/gE^-/gI^-免疫猪不产生针对gE的抗体。育肥猪在二次免疫后中和抗体水平显著升高。以10^5.0 TCID50和10^6.0 TCID50疫苗病毒接种家兔、猫和奶山羊等非靶动物，结果非靶动物未出现精神异常或死亡现象，说明该基因缺失疫苗具有极高的生物安全性。     

猪圆环病毒(PCV)序列分析与进化

从 Gen Bank数据库下载了世界各地分离的猪圆环病毒基因组全序列 ,并对其进行多重比对 ,绘制系统进化树 ,发现来自同一国家或地区的 PCV毒株亲缘关系较近。提取 PCV ORF1编码的蛋白质序列 ,进行多序列比较 ,分析保守氨基酸序列 ,搜索结构域相似序列 ,结果发现玉米线条病毒属与 PCV的起源有密切的关系。此外 ,在数据处理过程中通过自编程序结合互联网及免费软件 ,能迅速进行大规模序列比较分析 (35个序列以上 ) ,提高了生物数据分析处理的速度。     

施用精制有机肥对马铃薯产量的影响

通过精制有机肥在马铃薯上的肥效试验,研究其对马铃薯鲜薯产量的影响,为该肥料在马铃薯生产上推广应用提供科学依据。试验采用单因素随机区组设计,结果表明:精制有机肥对马铃薯有明显的增产效果,就增产(产量和纯产值)幅度来说,以处理4施精制有机肥80 kg/667 m2最高,就投产比来说,以处理3施精制有机肥60 kg/667 m2最佳(投产比为1:3.46)。     

抗伪狂犬病毒Ea株单克隆抗体的制备及鉴定

将伪狂犬病毒Ea株纯化后免疫雌性Balb/c小鼠,取其脾细胞与SP2/O的骨髓瘤细胞融合,用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)进行筛选,获得了2株抗PRV的单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为3G7E3和4A6F5,其细胞培养上清及小鼠腹水效价(ELISA)分别为1:212、1:212及1:100×212、1:100×212。特异性试验和免疫荧光结果显示,3G7E3和4A6F5仅与PRV反应,而与PPV、PRRSV、JEV和HCV等病毒不发生交叉反应;用单抗建立的夹心ELISA试验能检出伪狂犬病毒。表明本研究所获得的2株单抗是PRV特异性的。这2株分泌抗PRV单抗的杂交瘤细胞株的获得为进一步建立准确快速的抗原检测方法奠定了基础。     

犬细小病毒的分离鉴定与生物学特性分析

本研究旨在获得华中地区的犬细小病毒分离株并对其基因型分型、生物学特性及致病力进行探讨.从武汉部分宠物医院采集胶体金初检阳性的14份可疑病料,用猫肾细胞(F81)进行病毒分离.根据犬细小病毒2型(CPV-2)保守的VP2,先后设计2对引物,进行PCR扩增.在细胞上对其进行空斑纯化,进行一步法生长曲线测定,并进行电镜观察.最后对这5株病毒都进行动物回归试验.细胞传代结果表明得到5株细小病毒.PCR扩增结果表明获得390和583 bp 2个片段.将2个片段测序的结果与GenBank发布的CPV-2比对,表明所获得的5株病毒中,有4株属于2a型,1株属于2b型.空斑纯化及生长曲线绘制结果表明分离毒株增殖滴度可达105.5PFU·mL-1.电镜观察结果表明,感染细胞的线粒体肿胀.动物试验结果表明犬都能表现不同程度的发病状况,大体解剖发现肠管有坏死、心肌变薄.将病变的心脏制作切片观察,结果表明心肌细胞变性、坏死.本研究结果为进一步研究CPV-2的分子生物学和分子致病机理奠定了基础.     

猪伪狂犬病和传染性胸膜肺炎混合感染

发病情况。某场存栏生产母猪593头，2002年4月份产仔347头，其中弱仔4头，占1.2％；木乃伊18头，占6.95％；死胎51头，占14.7％。新生仔猪一周龄内死亡57头，占16.4%，断奶(30d)前死亡81头，占23.3％，共计损失211头，育成率为39.2％。母猪近情率20％。20％左右育肥猪发病，死亡8头。