不同放牧环境下绵羊牧食行为的比较研究

为了研究同品种绵羊在不同放牧环境下的牧食行为差异,在典型草原区沙质草地和高平原草地两种放牧环境下,对四品种双杂交杂种绵羊的牧食行为进行了观察.结果表明:不同放牧环境下绵羊的采食时间和游走时间占放牧时间的80%左右,放牧环境对采食行为有显著的影响.绵羊在沙质草地采食和游走时间占总放牧时间的66.54%和15.63%,在高平原草地为77.49%和7.79%.不同放牧环境下卧息、站立等时间存在显著差异.     

靶向新城疫病毒L基因(功能区)的siRNA抑制新城疫病毒的复制

本研究以新城疫病毒（NDV）L蛋白的功能区（P1595、P2103和P3277酶活性中心结构区）序列为RNAi的靶位点,设计、构建了3个特异性的siRNA的真核表达质粒pSi-L6、pSi-L7和pSi—L9,转染到CEF细胞后接种NDV。间接免疫荧光实验结果显示：pSi-L6、pSi-L7和pSi-L9均能抑制NDV抗原蛋白的表达;Real-time PCR检测到转染pSi-L6、pSi-L7和pSi-L9的CEF细胞中L基因的转录水平分别降低79.1％、93．9％和91.3％,P基因的转录水平分别降低73％、86、3％和89．8％;病毒滴度测定表明转染pSi-L6、pSi-L7和pSi-L9质粒的细胞培养上清中病毒的滴度分别低2、19、3、16和5．24倍。本研究中3个特异性的siRNA均能抑制NDV的复制、增殖,表明P1595、P2103和P3277这3个区域对于L蛋白发挥RNA依赖的RNA聚合酶的功能具有重要作用。     

一株猫疱疹病毒Ⅰ型的分离与鉴定

采集哈尔滨某猫舍中表现为上呼吸道感染的患病猫眼、鼻拭子,PCR初步确诊为猫杯状病毒(FCV)和猫疱疹病毒(FHV-1)混合感染。利用猫肾细胞(CRFK)对样本进行病毒分离,前两代细胞培养物的核酸检测结果为FHV-1和FCV阳性,第三代开始只有FCV阳性,由此分离出FCV。制备此株FCV的鼠源多克隆抗体,并中和混合培养物中的FCV,从而分离出FHV-1,命名为HRB2019株。通过病毒粒子形态观察、间接免疫荧光试验(IFA)和基因序列分析等方法鉴定HRB2019株,并研究其体外生长动力学。结果显示,HRB2019株可在CRFK细胞上产生典型病变,测得其第四代病毒滴度为1×10^8.43TCID₅₀·mL^-1;电镜下可观察到球形、有囊膜、直径约为200 nm的病毒粒子;IFA结果显示,分离株可与FHV-1阳性血清结合,出现特异性荧光;扩增分离株的gD基因,其与国内外流行株高度同源。病毒一步生长曲线表明,HRB2019株感染细胞12 h后开始复制增殖,12～36 h为快速增殖期,48～72 h进入增殖平台期且滴度达到高峰,84 ...     

多杀性巴氏杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种多杀性巴氏杆菌(Pm)快速敏感的检测方法,本实验根据Pm70株kmt1基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针,建立了该菌的TaqMan荧光定量PCR检测方法,并优化了检测反应条件。本实验建立的荧光定量PCR方法可以特异性检测Pm,而对鸭疫里默氏杆菌、支气管败血波氏杆菌等菌株检测结果均为阴性,表明该方法具有良好的特异性。该方法对C48-1株标准品的检测灵敏度为1.75×10~1拷贝/μL,优于常规PCR检测方法(1.75×10~3拷贝/μL) 100倍;组内和组间重复性试验的变异系数均小于2%,具有良好的重复性。对20份疑似感染的临床病料样品(鸡肝脏、牛肺脏)进行增菌培养和分离鉴定,结果分离到8株多杀性巴氏杆菌;以建立的荧光定量PCR方法与常规PCR方法对增菌培养液进行检测,阳性率分别为40%(8/20)和25%(5/20),且荧光定量PCR方法与常规细菌分离鉴定的符合率为100%。对C48-1株感染致死的20份小鼠肝脏和脾脏组织研磨液进行检测,阳性率均为100%。本研究建立的方法能够快速、敏感的检测Pm,对于其临床和实验室的快速诊断具有重要意义。     

犬瘟热病毒F蛋白融合信号肽单克隆抗体的制备及其表位的鉴定

为制备犬瘟热病毒(CDV)F蛋白融合信号肽(FSP)的单克隆抗体(MAb),本研究通过原核表达系统表达CDV HLJ1-13株重组FSP蛋白(rFSP)。将其免疫BALB/c小鼠,通过间接ELISA方法筛选到1株能够稳定分泌抗FSP蛋白MAb的杂交瘤细胞株G8D6E3E5,亚类鉴定结果显示该株MAb重链为Ig G2a型,轻链为κ型。构建一系列表达部分重叠的重组FSP片段,经western blot鉴定该株MAb识别的抗原区域为aa1～aa55,通过合成一系列重叠多肽,经ELISA进一步鉴定该株MAb识别的抗原表位为²¹QQHSTRSTET³⁰。采用western blot检测该株MAb与r FSP的反应原性;采用间接免疫荧光试验(IFA)检测该株MAb与天然FSP的反应原性。Western blot结果显示,CDV Snyder Hill和HLJ1-13株r FSP蛋白样品在34 ku左右均出现特异性条带;IFA结果显示,感染CDV Snyder Hill株48 h后的vero细胞出现红色荧光。以上结果表明,该株MAb既能够与原核表达的CDV...     

兔多杀性巴氏杆菌和兔出血症病毒双重PCR检测方法的建立及初步应用

为建立兔多杀性巴氏杆菌(Pm)和兔出血症病毒(RHDV)的双重PCR检测方法,本研究根据Pm kmt1基因和RHDV VP60基因保守区域,设计2对特异性引物,经PCR分别扩增Pm kmt1基因和RHDV VP60基因保守区域,构建重组质粒p MD-Pm和p MD-RHDV,并经菌液PCR和测序鉴定后作为重组质粒标准品。经各反应条件优化后初步建立了检测Pm和RHDV的双重PCR方法。反应条件优化结果显示,该方法的最适退火温度为59℃,扩增kmt1和VP60基因的最优引物浓度均为0.5μL (10μmol/L)。对Pm和RHDV及其他病原包括兔源支气管败血波氏杆菌、产气荚膜梭菌等20种相关病原的特异性试验结果显示,除Pm和RHDV有特异性扩增条带外,其余相关病原均无扩增条带,特异性较强。将两种重组质粒标准品分别10倍倍比稀释并等体积混合后作为模板,经该双重PCR方法扩增。结果显示,该方法对p MD-Pm的检测限为17.9拷贝/μL,对p MD-RHDV的检测限为1 260拷贝/μL,敏感性较高;对两种病原的DNA和cDNA混合物的批内和批间重复性试验结果均一致,重复性较好。对100份临床...     

犬细小病毒ELISA抗体检测试剂盒的研制及应用

本研究以纯化的犬细小病毒(CPV)重组VP2蛋白为包被抗原,建立了检测CPV抗体的间接ELISA 方法,其抗原包被浓度为0.158μg/mL;待检血清稀释倍数为1:100,作用时间为60 min;羊抗犬酶标抗体稀释倍数为1:2 000,作用时间为60 min;底物作用时间为10 min;判定标准为S/P≥O.282时为阳性,S/P≤0.226时为阴性.该方法与犬瘟热、犬传染性肝炎、犬副粘病毒病、犬波特氏杆茵痛等4种犬常见传染病阳性血清无交叉反应,具有较好的特异性;批内、批间重复试验变异系数均小于15%,显示该方法具有良好的重复性;与商品化CPV ELISA试剂盒进行比较,符合率为96.5%.本研究为现地免疫犬群抗体监测和进行CPV流行病学调查提供了一种简便的血清学诊断方法.     

检测猫杯状病毒RT-qPCR方法的优化与应用

为建立一种通用性良好的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法,根据GenBank上猫杯状病毒(feline calicivirus, FCV) ORF1保守区域序列,设计合成1对特异性引物,用于FCV的快速检测。灵敏性试验结果显示,该方法的检测下限为4.93×10¹拷贝/μL,比普通RT-PCR检测下限高100倍;特异性试验结果显示,该检测方法与猫疱疹病毒、猫细小病毒、猫传染性腹膜炎病毒等无交叉反应;通用性试验结果显示,针对引物靶位点区间,该方法对所有已知变异位点的人工合成质粒和本实验室保存的不同变异位点的FCV毒株,均能够良好检出;重复性试验结果显示,组内的变异系数为0.09%～0.71%,组间变异系数为0.05%～0.82%,均小于1%。对23份临床样品进行检测,该方法的阳性检出率为60.9%,检出的14份阳性病料分别接种到CRFK细胞中,对细胞病变产物进行扩增并测序,BLAST对比后结果证实为FCV毒株。结果表明,本试验建立的荧光定量RT-PCR检测方法可用于FCV的快速诊断及流行病学的调查。     

支气管败血波氏杆菌Δhfq突变株构建及生物学特性分析

为研究Hfq蛋白在支气管败血波氏杆菌(Bb)的致病作用,本研究采用同源重组技术,将卡那霉素抗性基因替换Bb122株的hfq基因,构建BbΔhfq突变株。将其连续传20代,Δhfq突变株具有良好的遗传稳定性。生化检测试验表明,突变株与亲本株未发生明显改变。此外,在37℃培养时,突变株与亲本株生长曲线无明显差异,但在42℃培养时,突变株的生长曲线略低于亲本株。抗逆性试验表明,突变株与亲本株在紫外线照射和50℃条件下,亲本株的耐受能力均显著高于突变株(p0.05)。然而,将亲本株与突变株分别以2×109cfu/只腹腔接种小鼠时,亲本株接种小鼠全部死亡,而突变株接种小鼠则全部存活,表明Hfq蛋白与该菌的致病性有关。本研究为进一步研究Hfq蛋白的功能及其在Bb致病机制中的作用奠定了基础。