猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒2型与猪巴氏杆菌病混合感染的诊断和控制

2008年9月,四川龙泉某猪场发生以高热、呼吸困难为主要特征的高热病,经流行病学调查、临床诊断结合实验室病原学检查,确诊该疫情是由猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒2型与猪巴氏杆菌病的混合感染引起。药敏试验结果显示,巴氏杆菌对阿米卡星、阿奇霉素、环丙沙星等药物高度敏感。用敏感抗生素配合自家组织苗控制了本次疫情。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因疫苗的构建及其在Marc-145细胞中的表达

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）LV和VR-2332株的核苷酸序列,设计合成了1对特异性引物,对PRRSV四川分离株SC1和SC2进行RT-PCR,扩增出病毒ORF5基因。利用真核表达质粒pcDNA3．1（＋）成功构建了PRRSV四川分离株ORF5基因疫苗pcDNA-PRRSV-SC1-ORF5和pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5。通过脂质体转染法和电穿孔转染法将pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5转染Marc-145细胞,间接免疫荧光技术跟踪监测ORF5基因的表达情况,结果表明,脂质体转染法和电穿孔转染法分别在转染26h和23h后检测到ORF5基因特异性表达产物,且随着培养时间的延长,特异性表达产物增多,两者均在56h达到高峰;这证明pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5在Mare-145细胞中已高效表达,为PRRSV基因疫苗在临床上应用提供了实验依据。     

DNA Ladder和ELISA联合检测PRRSV诱导Marc 145细胞凋亡动态变化规律的研究

对PRRSV诱导Marc145细胞凋亡的动态变化规律进行了研究,实验收集PRRSV SC1株感染Marc145细胞后0、24、48、72、96、120、144h和同一时间点未接毒的细胞样品,用DNALadder定性检测和ELISA定量检测细胞凋亡的变化规律。定性检测结果表明,PRRSV能诱导Marc145细胞发生凋亡,病毒感染后凋亡细胞DNA电泳呈典型“梯状”条带。定量检测结果表明,Marc145细胞在PRRSV感染后24h开始出现凋亡,48h凋亡更加明显,72h达到高峰,明显高于对照组。     

间接免疫酶组织化学法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒感染和抗原定位

以蔗糖密度梯度离心法提纯的猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）病毒SC1株作为抗原,免疫家兔制备兔抗PRRS病毒IgG,成功建立了检测PRRS病毒抗原的间接免疫酶组织化学法。该方法只与PRRS病毒感染猪组织呈现阳性反应,与猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪乙脑病毒人工感染并致死仔猪的肝脏组织呈现阴性反应。用该方法检测PRRS SC-1株人工感染28日龄仔猪,在感染后7 d即可在肺门淋巴结、胸腺、扁桃体、十二指肠、肺、大脑和肾脏检测到PRRS病毒抗原。PRRS病毒抗原主要分布于胸腺和十二指肠感染细胞的胞浆内、肺门淋巴结小梁周围的淋巴窦和弥散的淋巴组织、扁桃体淋巴结的隐窝及其周边。该法具有特异、直观和敏感的特点,可用于PRRS病毒感染的实验室诊断、抗原定位及甲醛固定样本的回顾性诊断。     

TUNEL法检测PRRSV感染Marc-145细胞凋亡的研究

为了研究PRRSV诱导Marc-145细胞凋亡的动态变化规律，收集PRRSV-SC1株感染Marc-145细胞后0h、24h、48h、72h、96h、120h、144h和相同时间点未接种病毒的细胞样品，采用TUNEL法进行细胞凋亡的检测。结果表明，PRRSV能诱导Marc-145细胞发生凋亡；在PRRSV感染后24h开始出现凋亡，48h凋亡更加明显，72h达到高峰，随后细胞凋亡水平又有所下降，在感染后144h，细胞的凋亡水平低于正常组。     

PRRSV感染Marc-145 细胞凋亡的形态学观察

研究PRRSV感染与细胞凋亡的关系及调亡的可能机制将有助于人们认识PRRSV感染性的发生、发展及转归机制,为进一步阐明PRRSV的致病机制和该病的防治提供一些新的思路.