新型鸭呼肠孤病毒σC蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

为了解新型鸭呼肠孤病毒(NDRV TH11株)σC蛋白的抗原性,采用RT-PCR方法扩增了NDRV TH11株σC蛋白的编码基因,将其克隆于原核表达载体pET-30a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达His-σC重组蛋白。SDS-PAGE和Western blot分析表明该重组蛋白获得高效表达,并具有较好的反应原性。以纯化的σC蛋白免疫实验兔制备了抗σC蛋白的多克隆抗体,间接ELISA检测结果显示其效价达1∶20 000以上;间接免疫荧光试验表明,多克隆抗体能够特异性识别NDRV的σC蛋白,显示出σC蛋白具有良好的免疫原性。     

兔病毒性出血症病毒次要结构蛋白（VP2）的表达和细胞内定位分析

病毒蛋白VP2是兔出血症病毒（Rabbit Hemorrhagic Disease Virus,RHDV）的一种次要结构蛋白。本文旨在构建VP2与绿色荧光蛋白融合的真核表达载体,进而利用它研究VP2在细胞内的定位情况。首先在大肠杆菌中表达GST-VP2融合蛋白,然后用纯化的重组蛋白免疫小鼠制备抗VP2的抗血清。对制备的抗VP2抗血清进行特异性分析,再利用该抗体对转染pEGFP-VP2的BHK-21细胞进行检测,以研究VP2蛋白在细胞内的定位情况。结果表明,pEGFP-VP2转染BHK-21细胞后,不仅VP2蛋白得到了成功表达,而且通过检测偶联的绿色荧光蛋白可判断出VP2蛋白主要分布于BHK-21细胞的细胞质。本研究成功构建了VP2与绿色荧光蛋白融合的表达载体,并在真核细胞内实现了表达,通过检测荧光蛋白,发现VP2主要在细胞质内表达并分布,为深入探讨VP2的生物学功能奠定了基础。     

我国北部一淡水湖野生黑颈??死亡的原因调查

2015年5月14—15日,内蒙古自治区某淡水湖出现大量黑颈??死亡。5月21日,内蒙古自治区动物疫病预防控制中心组织相关专家赶赴现场,开展了紧急流行病学调查,分析黑颈??的死亡原因,评估该事件对当地家禽养殖的风险。调查结果显示:此次事件中的黑颈??死亡率约为46.2%,未发现有其他鸟类和家禽死亡;该淡水湖周围5 km范围内的其它地点未有禽类死亡,对该范围内的活野鸟和家禽进行抽样检测,未检出禽流感病原,但国家禽流感参考实验室从送检的死亡野鸟病料样品中均检出H5N1亚型高致病性禽流感病毒,并且检测发现该区域内家禽的H5亚型禽流感免疫抗体合格率较低;在野鸟向家禽传播疫病的7个风险因素中,家禽养殖方式、家禽免疫状况的风险程度较高。调查认为,本次黑颈??死亡事件是由其自身所携带的禽流感病毒暴发所引起的,该区域内家禽发生疫情的风险不高。     

口蹄疫感染性克隆疫苗的发展前景

口蹄疫是一种严重威胁畜牧业发展的重要传染病 ,目前世界上许多国家和地区都有该病的流行与发生。开展新型口蹄疫疫苗的研究一直是口蹄疫防制技术的一项重要内容。鉴于传统疫苗所存在的诸多缺点 ,人们先后研制开发了口蹄疫的第二代基因工程苗和第三代基因疫苗 ,这些新型疫苗都具有一定的优越性 ,显示出进一步发展的潜力。文章着重讨论了在感染性 c DNA的基础上所构建的一类新型基因疫苗—感染性克隆疫苗及其发展前景。感染性克隆疫苗不仅继承了以往基因疫苗的许多优点 ,而且克服了其表达量低 ,免疫效果不理想的缺点 ,为新型疫苗的研制提供了一种新的思路     

鸭呼肠孤病毒基因Ⅰ型与Ⅱ型鉴别诊断RT-PCR方法的建立与应用

临床发病鸭(Anas platyrhynchos domestica)群中存在两种基因型鸭呼肠孤病毒(Duck reovirus,DRV)的感染.为建立一种能鉴别诊断DRV Ⅰ型(classical DRV,C-DRV)与Ⅱ型(novel DRV,N-DRV)的一步法RT-PCR检测方法,本研究通过对GenBank已公布的现有C-DRV和N-DRV S1和S4基因片段序列进行比对分析,设计合成两对特异性引物,并对引物浓度、退火温度和循环次数等扩增条件进行优化,建立一种能鉴别诊断C-DRV和N-DRV的一步法RT-PCR检测方法.结果表明,一步法RT-PCR最佳的反应体系为:PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1μL,2×1 Step Buffer 12.5μL,RNA模板1.5μμL,上下游引物(20μmol/L)各1μL,RNase Free dH2O补足25 μL;最佳反应条件:50℃反转录30 min;94℃预变性2 min;94℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,共30个循环.该方法可从C-DRV和N-DRV基因组中扩增出大小分别为249和505 bp单一特异性片段,从两种病毒基因组混合物中可同时扩增出两条特异性片段,而对鸭源常见病毒及正常细胞基因组在同等条件下检测均为阴性;该方法具有较高的敏感性,其最低病毒检出量分别为0.47和0.62个半数组织培养感染剂量(50％ tissue culture infective dose,TCID50);对不同代次、不同时间提取的病毒RNA样品重复检验3次,结果均一致.对浙江省2011～2015年采集的239份疑似临床病料进行检测,C-DRV与N-DRV的阳性率分别为2.5％(6/239)和31.4％(75/239);通过对阳性病料P10和P18扩增序列的测序也证实检测结果的准确性.本研究建立的双重一步法RT-PCR可以有效区分两种基因型DRV,且临床样品检测表明N-DRV是浙江省流行的优势基因型.本研究为鉴别诊断C-DRV与N-DRV提供了一个快速、灵敏性高及低成本的实验室诊断方法,该方法的建立可为DRV的分子流行病毒学调查提供有效的技术支持.     

中国兔病毒性出血症病毒衣壳蛋白基因的克隆及遗传变异分析

对中国兔病毒性出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV)JX/97株的衣壳蛋白基因进行了克隆和测序。结果表明，该蛋白的核苷酸序列长度为1739 nt，推导的氨基酸序列为579 aa。利用分子生物学软件分析了该病毒与国内外22株RHDV的基因序列，结果显示，RHDV不同分离株之间的序列同源性几乎都在90％以上。衣壳蛋白基因的系统发生树分析结果表明，所选的RHDV参考毒株按照一定的遗传距离，可以分为4个基因群，基因群之间的距离有加大的趋势，表明RHDV受环境的影响有向不同方向演变的趋向，即RHDV在长期适应特定环境的过程中，有可能逐渐演变成各具特色的RHDV。     

DEV囊膜糖蛋白gI基因缺失病毒生物学特性研究

在构建鸭瘟病毒疫苗株细菌人工染色体感染性克隆pDEV-vac的基础上,通过两步Red E/T重组,构建了gI基因缺失的pDEV-ΔgI突变体克隆,并转染鸡胚成纤维细胞获得了重组病毒rDEV-ΔgI。病毒生长曲线显示,rDEV-ΔgI的滴度从12 h到60 h稳步增加,在此期间gI基因缺失毒株病毒滴度较亲本毒株稍有降低,但病毒滴度于72 h接近并超过对照毒株。蚀斑面积测定发现rDEV-ΔgI较亲本毒rDEV-BAC增加约60%。动物实验表明,rDEV-ΔgI注射组对强毒攻击的保护率较对照组下降40%。研究表明:gI为DEV的非必需基因,且gI基因与病毒扩散、免疫保护能力等相关。     

A型鸭肝炎病毒微基因组的构建

为研究A型鸭肝炎病毒(DHAV)非编码区的结构和功能,笔者拟构建该病毒的微基因组并对其进行初步鉴定。采用酶切的方法将萤火虫荧光素酶报告基因(fLuc)与A型鸭肝炎病毒的ORF进行替换;并在5′UTR上游插入海肾荧光素酶报告基因Rluc作为内参基因;同时还在Rluc上游引入锤头状核酶,3′UTR下游引入丁型肝炎核酶,至此得到了含有双报告基因的A型鸭肝炎病毒微基因组(pRluc-fLuc)。将pRluc-fLuc转染DF-1细胞,8h便可以检测到报告基因的表达,24h表达量达到峰值。上述结果表明,已经成功构建了A型鸭肝炎病毒微基因组,这为进一步研究病毒非编码区的结构和功能以及病毒的翻译或复制的调控机理提供了良好的技术平台。     

侧流免疫层析技术在兽医诊断中的应用

侧流免疫层析使用有色标记物、荧光标记物或其他标记物等作为标记物,用于偶联抗原(抗体),用以检测抗体(抗原)的一种免疫化学反应。传统的侧流免疫层析依赖于肉眼观察,灵敏度较低,只能提供定性或半定量结果。新一代侧流免疫层析技术采用不同类型标记物和应用外部设备,对待检物进行量化,来呈现待检物的含量,从而实现开发具有定量、多组分检测能力的免疫层析测试。论文总结了侧流免疫层析标记物、检测原理以及在兽医诊断中的应用,以期为今后侧流免疫层析技术在兽医临床诊断中的应用和改进提供理论参考。