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本研究旨在检测p21基因在牛卵成熟过程中的表达,并构建其真核表达载体。首先利用RT-PCR和免疫荧光染色对不同成熟阶段牛卵内p21的mRNA和蛋白表达进行检测。然后从牛成纤维细胞中克隆了p21基因并构建pVenus-P21真核表达载体。经脂质体2000介导重组质粒pVenus-P21转染Hela细胞,通过荧光显微镜观察、RT-PCR检测,确认重组质粒在Hela细胞内的表达及定位。最后应用体外转录试剂盒将p21-venus体外转录为cRNA,并注射牛卵母细胞,荧光显微镜下观察其表达及定位。结果显示,在牛卵体外成熟过程中,各时期均存在p21基因mRNA及蛋白的表达。构建的真核表达载体pVenus-P21能够在Hela细胞中正确表达及定位。p21-venus cRNA显微注射牛卵后其融合蛋白也能实现准确定位,为研究P21在卵母细胞成熟以及胚胎发育过程中的作用奠定了基础。 相似文献
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牛nanog基因原核表达载体构建及其在大肠杆菌中的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
从6周龄的胎牛（Bos taurus）原始生殖嵴中提取总RNA,通过RT-PCR扩增nanog基因,将其克隆到PMD-18T载体,然后再亚克隆到pGEX-KG表达载体上,获得原核表达质粒pGEX-KG-nanog,限制性内切酶分析和DNA测序证明所插入片段为牛nanDg基因编码序列。重组质粒转化大肠杆菌JM109（Escherichia coli）,在不同的培养温度（25、30和37℃）和不同浓度的IPTG（0．10、0．25、0．50、1．00和2．00mmol／L）诱导下均获得了表达,结果表明,培养温度和IPTG浓度对GST-Nanog融合蛋白在大肠杆菌中的表达影响甚微;经Western blot检测证实该蛋白约60kD,并具有GST抗原活性,证实目的蛋白为Nanog蛋白。 相似文献