鸡X期胚盘细胞电转染外源基因条件的探索

以EGFP为报告基因体外电穿孔转染鸡X期胚盘细胞,探讨适宜电转染条件以及影响鸡ES细胞存活率和转染率因素。分离鸡X期胚盘细胞进行培养、传代及鉴定,二代细胞设定不同的电压、脉冲时间、质粒浓度、细胞密度及孵育温度等条件转染。电击后10 min,0.4%台盼蓝染色,血细胞计数板计数,计算存活率。48 h后在荧光显微镜下计绿色荧光细胞数和总细胞数,计算转染率。结果表明:电转染鸡ES细胞的最优化电压为280 v,脉冲时间为75μs,质粒浓度为20μg/mL,转染前4℃、转染后25℃(室温)或4℃各静置10 min,细胞密度调整在1×105个/mL×106个/mL,尽量使细胞处于对数生长期。电穿孔法转染鸡ES细胞是简便有效的方法,利用优化条件转染ES细胞,可以满足进一步实验的要求。     

牛结核分枝杆菌溶血磷脂酶真核表达载体的构建及在Hela细胞中的表达

为了研究牛结核分枝杆菌溶血磷脂酶基因(Lip)的生物学特性及其功能,试验构建了Lip-pEGFP融合基因的真核表达载体,利用脂质体(lipofectamine2000)将其转染到Hela细胞中,用荧光显微镜检测GFP在细胞中的表达情况。结果显示,重组Lip-pEGFP载体在Hela细胞中获得了高效表达,且能够稳定传代,为进一步研究Lip的生物学功能及其在牛结核分枝杆菌中的作用奠定了基础。     

河南不同临床型鸡支气管炎病毒流行毒株的分离鉴定及其S1基因变异分析

经鸡胚接种、RT-PCR、气管环培养等方法从河南地区发病鸡群中分离、鉴定出2株鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitic virus,IBV),分别命名为HN/HL株和HN/SG株。应用RT-PCR方法对尿囊液中HN/HL株和HN/SG株以及本室保存的H120株的S1基因全序列进行了扩增,并对其进行克隆测序。结果显示,3株IBV目的片段全长分别为1828、1825、1819bp,3个序列相互之间存在多位点的变异,同时存在插入和缺失现象;对推导的氨基酸序列进行分析表明,HN/HL株S蛋白裂解识别位点序列为HRRRR,而HN/SG株和H120株S蛋白裂解识别位点同为RRFRR。将测序结果同GenBank上登录的其他IBVS1基因相比较,发现本试验的HN/HL株与疫苗H120株的同源性仅为78.1%,HN/SG株与H120株的同源性仅为81.1%,而HN/HL株与HN/SG株的同源性为87.9%。同源性及遗传进化分析还发现,已报道的腺胃型ZJ971株和QX株在分子水平上应该分别属于呼吸型和肾型IBV。     

“芪蓝饮”及不同提取成分对NDV在鸡胚成纤维细胞中增殖的影响

为评价新兽药芪蓝饮及其不同提取成分的体外抗病毒活性,本试验通过细胞病变抑制法和MTT比色法检测了各提取成分对新城疫病毒(NDV)感染鸡胚成纤维细胞(CEF)过程的影响。结果显示,在3种加药方式中芪蓝饮原药(QLY)直接杀灭NDV的作用最强,其抑制率最高为128.85%;原药总多糖(TPS)干扰NDV的增殖作用最强,其抑制率最高为130.23%;原药总萜类(TT)直接杀灭NDV的作用最强,其抑制率最高为146.15%;板蓝根总生物碱(RIA)及其水溶性部位(RIAw)和酸性部位(RIAa)对抗NDV的方式是多环节的。综上所述,芪蓝饮及其提取成分表现出较强的干扰NDV增殖和直接杀灭NDV的作用,而阻断作用稍弱。     

牛星状病毒EvaGreen实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

牛星状病毒(BAstV)是我国新发的犊牛腹泻病原,本试验的目的是建立检测BAstV的Real-time PCR方法.根据BAstV流行株的ORFla基因序列设计引物,通过优化反应条件和体系,成功建立基于EvaGreen检测BAstV的Real-time PCR方法.结果表明,该检测方法的Ct值与标准品模板在1.36×1...     

VP2蛋白Cys-402、Cys-214对猪细小病毒VLPs影响的初步研究

试验以猪细小病毒VP2 Cys-402(A)、Cys-214(B) 定点突变体为基础,将突变体真核表达载体转染COS-7细胞及核酸免疫猪细小病毒抗体阴性的小白鼠,通过电镜技术和流式细胞仪技术探讨突变Cys-402、Cys-214对猪细小病毒病毒样颗粒的影响,旨在寻找利于外源基因插入的病毒样颗粒内部位点.电镜和小白鼠核酸免疫试验结果表明:Cys-214对病毒样颗粒的组装和免疫原性的发挥是必需的,其突变后不能促使VP2形成病毒样颗粒,更不能在免疫后的小白鼠血清中监测出相应抗体的存在;而Cys-402的突变并不干扰病毒样颗粒的形成和免疫原性的发挥.由此可以推测Cys-402及其附近可能存在利于外源基因插入的位点.     

玉米赤霉烯酮对小鼠脾淋巴细胞凋亡的影响

采用MTT法、DNA ladder分析、流式细胞仪分析等方法,离体研究玉米赤霉烯酮对小鼠脾淋巴细胞增殖与凋亡的影响,结果发现:ZEA对离体培养LPS活化小鼠脾淋巴细胞增殖具有显著抑制作用(P<0.05),且抑制强度与其剂量和处理时间均呈依赖性关系;小鼠脾淋巴细胞经ZEA处理后,出现DNA断裂等典型细胞凋亡特征;ZEA对离体培养LPS活化小鼠脾淋巴细胞具有显著促凋亡作用(P<0.0 5),且促进强度与其剂量呈依赖性关系。这些结果表明,玉米赤霉烯酮对小鼠脾淋巴细胞有直接毒害作用。     

添食氟化物后雌雄家蚕中肠和头部氟离子的吸收累积规律

为了探讨氟离子在雌雄家蚕中肠和头部的吸收累积情况,以家蚕耐氟品种T6和氟化物敏感品种734为研究材料,按照常规方法饲养到5龄起蚕时,对2品种家蚕进行雌雄鉴别,并将其分区饲养.添氟组喂食经200mg/kg NaF溶液浸泡后的桑叶,另设清水对照组,检测不同性别家蚕中肠和头部氟离子浓度的积累情况.结果表明,在中肠中,对照组734和T6雄蚕氟离子浓度分别高雌蚕1.20倍和1.03倍,添氟组734和T6雄蚕均是雌蚕的1.05倍.734雄蚕添氟组是对照组的1.67倍,而雌蚕添氟组是对照组的1.58倍.T6雄蚕添氟组是对照组的1.22倍,而雌蚕添氟组是对照组的1.20倍.在头部,对照组734和T6雄蚕分别是雌蚕1.39倍和1.08倍,添氟组734和T6雄蚕分别约是雌蚕的1.10倍和1.03.734雄蚕添氟组是对照组的1.10倍,而雌蚕添氟组是对照组的1.39倍.T6雄蚕添氟组是对照组的1.10倍,而雌蚕添氟组是对照组的1.03倍.两种组织中,均表现出雄蚕中的氟离子浓度高于雌蚕的.     

禽流感病毒H9N2亚型三重PCR检测方法的建立

为建立简便快速检测禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)并同时区分出H9、N2亚型的方法,本试验根据基因库中H9亚型AIV的HA基因、N2亚型AIV的NA基因及AIV的M基因序列,分别设计了3对针对这3种基因保守序列的引物,建立了AIV H9N2亚型的三重PCR检测方法。应用该方法对H9N2亚型AIV模板进行PCR扩增,可得到3条与试验设计相符的目的条带,分别为313 bp (HA基因)、451 bp (NA基因)和667 bp(M基因);对非H9亚型的N2亚型AIV模板进行扩增,出现2条特异性扩增条带,即451 bp (NA基因)和667 bp(M基因);对非H9、N2亚型AIV模板进行扩增则只出现一条目的条带,即667 bp(M基因);对其他禽呼吸道病原体进行PCR扩增,结果均为阴性。敏感性试验结果显示此三重PCR方法最低检出限为10^-2 ng/μL。应用所建立的三重PCR方法对120份临床病料进行检测的结果与病毒分离鉴定结果一致。各项试验结果均表明,该方法对于禽流感病毒尤其是H9、N2亚型禽流感病毒的检测具有快捷、特异、灵敏的特点。     

水貂TYR基因T138A位点多态性及其与毛色性状的关联分析

试验旨在检测水貂酪氨酸酶（tyrosinase,TYR）基因T138A位点的多态性,并分析其与水貂毛色表型的相关性。提取5种被毛色型430只水貂血液基因组DNA,采用PCR-RFLP技术,对TYR基因T138A位点进行多态性检测,统计等位基因频率与基因型频率,通过卡方（χ²）独立性检验分析该位点多态性与水貂毛色性状的相关性。结果表明,T138A位点存在2个等位基因T和A,形成TT、TA和AA 3种基因型,AA基因型在吉林白水貂群体中为优势基因型（0.9069）,而TT基因型为金州黑水貂、珍珠水貂、咖啡水貂和银蓝水貂群体的优势基因型,其中在金州黑水貂群体中基因型频率最高（1.0000）。关联分析表明,TYR基因T138A位点的多态性与毛色性状呈极显著相关（P<0.0001）。表明TYR基因T138A位点可能是影响水貂毛色的主控位点或与调控白色被毛表型主控位点连锁的分子标记。