RNA可视化原位杂交技术对感染细胞中猪瘟病毒RNA定位与分布

【目的】为研究CSFV RNA在体外感染细胞中的分布及定位,建立了一种准确、敏感的RNA可视化原位杂交技术。【方法】本研究通过比对GenBank公布的CSFV、BVDV和BDV全序列,避开BVDV和BDV的同源区,设计了CSFV RNA及内参基因β-actin的特异探针。以CSFV中等致病力毒株（HeBHH1/95）为参考毒株,在PK15细胞中培养病毒,加入RNA可视化原位杂交特异探针和相应试剂,采用荧光共聚焦显微镜进行成像观察。通过综合分析观测结果、荧光强度、重复性等因素,采用正交试验优化了对原位杂交过程中具有重要影响的蛋白酶K浓度和甲醛固定时间,建立了CSFV RNA可视化原位杂交技术,并与FAT方法比较该技术灵敏度;用我国目前流行的CSFV 1.1、2.1、2.2、2.3基因亚型及BVDV、PPV、PRV和PCV-2病毒进行特异性试验。最终,以CSFV强致病力毒株（SM）接种PK15细胞,病毒感染后0.5、1、3、6、8、10、14、18、24、36、48、72、96h(hours post inoculation,hpi)取样,每个时间点2个重复,采用CSFV RNA可视化原位杂交技术进行检测。为佐证病毒蛋白在细胞中的定位及分布,同时采用FAT方法对SM株E2蛋白在PK15细胞中的表达情况进行动态研究。【结果】采用该技术在荧光共聚焦显微镜下可观察到CSFV RNA在细胞中的定位;当蛋白酶K浓度为1:1 000、甲醛固定时间为30min时为最优反应条件;灵敏度试验表明该技术对病毒的检测极限为10-8/200μL,比FAT高3.5个数量级;特异性试验结果显示该探针能与CSFV 1.1、2.1、2.2、2.3亚型结合,与BVDV、PPV、PCV-2、PRV无交叉反应。采用该技术对CSFV RNA感染后在靶细胞中的定位与分布研究结果显示:0.5hpi在胞核和胞浆均能检测到RNA,0.5-6hpi RNA主要分布于胞核内并在核内富集;10hpi胞浆内RNA逐渐增多,胞核内RNA逐渐减少,24hpi RNA主要集中在胞浆内细胞核周围;36hpi核外RNA大量聚集增多,72hpi达到峰值;96hpi RNA总量有所下降。而FAT结果显示：8hpi在少数细胞的胞浆内检测到病毒E2蛋白,10-24hpi蛋白表达数量一直较少;36hpi蛋白表达量不断增多,72hpi到最大值;96hpi荧光信号由强变弱。病毒蛋白在细胞浆内的聚集数量与细胞浆中RNA含量成正相关。【结论】首次建立了CSFV RNA可视化原位杂交检测技术,并对CSFV强致病力毒株在细胞中的RNA定位分布进行了研究,发现病毒RNA吸附和进入靶细胞的时间早于0.5hpi,观察到CSFV RNA有在细胞核内的生活史。     

蒲公英无融合生殖特性初探

以丹东蒲公英为研究材料,利用常规压片法对去雄切柱头和在自然授粉条件下的种子根尖染色体进行观察,同时采用石蜡切片法观察丹东蒲公英胚珠发育情况。结果表明:丹东蒲公英为二倍体,人工去雄切柱头后的丹东蒲公英子房切片中可以观察到二分体的形成,一个退化,另一个经有丝分裂形成八核胚囊,卵细胞逐步发育为成熟胚,表明丹东蒲公英无融合生殖类型为二倍体孢子生殖。此外,丹东蒲公英去雄切柱头后的结籽率高达90.34%,发芽率为84%。     

镉在海藻中的化学形态

利用化学试剂逐步提取法研究了紫菜、海带、裙带菜和羊栖菜中镉的存在化学形态。研究结果表明:镉以多种化学形态存在于4种海藻中,1 mol/L氯化钠提取态镉和 2% 醋酸提取态的镉所占比例较大,两者约占总镉含量的76.3%～92.9%。0.6 mol/L盐酸提取态、去离子水提取态和80%乙醇提取态镉所占比例较小,其中乙醇提取态(离子态镉)约仅占总镉含量的0.4%～9.2%,且对于4种海藻,紫菜中的离子态镉所占比例最低(均小于1%)。实验进一步证实以海藻中总镉含量作为检测标准不能准确反映海藻及其制品的食用安全性,因此亟需建立海藻中针对毒性较强的离子态镉的检测标准限量和快速有效的检测方法,以保障我国海藻产业和出口创汇经济的顺利发展。     

玉米抗粗缩病基因STS分子标记的筛选

对与玉米抗粗缩病相关基因共分离的RAPD标记S37和S86扩增的产物进行克隆与测序,设计多对引物,以感病自交系478和抗病自交系齐319、P138和H21为材料进行PCR扩增。结果表明:根据RAPD产物1300bp片段转化的STS引物在感病自交系中扩增出特异带,而在抗病自交系中无此特异PCR扩增带。根据2000bp片段转化的STS引物同样在抗感病自交系中存在特异性差异。进一步用设计的两对STS-PCR引物Ⅰ-2和Ⅱ-4对20个感病自交系和34个抗病自交系进行验证,卡方测验表明,STS标记Ⅰ-2和Ⅱ-4与自交系抗感病的相关性达到极显著水平。STS-PCR标记Ⅰ-2和Ⅱ-4可直接用于玉米抗粗缩病的分子标记辅助选择育种。     

Studies on Tomato Seedling Quality Indices Under Simulated Shipping and Storage Conditions

Indices of the tomato seedling quality maintenance level after production before field planting were studied through simulated experiments, small--scale operation, indoor analyses and measurements, and field observation. The results showed that under simulated shipping and storage conditions, seedling quality change following different durations (days) of shipping and storage was correlated significantly or even very significantly with certain physiological and morphological indices. With various measured indices following different periods of shipping and storage treatment subjected to multinomial successive regressive correlation analysis, the principal factors influencing seedling quality maintenance level are identified to be chlorophyll content→dry short weight→ leaf freshness index in order of their importance. Significance analysis with multinomial fitted equation indicated that correlations between any one of above three factors and the growth index after field planting reached very significant difference level.     

饲料中脂肪水平对海湾扇贝性腺发育、脂肪酸组成和组织结构的影响

为了探讨配合饲料及其脂肪含量对海湾扇贝性腺发育、脂肪酸组成和组织结构的影响,在基础饲料中通过梯度添加鱼油（质量分数为0%、3%、6%和9%）配置4种脂肪质量分数为7%、10%、14%和17%的等氮饲料（质量分数为47%粗蛋白）,分别记为F7、F10、F14和F17,并以小新月菱形藻（Nitzschia closterium f. minutissima）作为对照组,试验在室内1 000 L的水槽中进行,每种饲料随机投喂3组扇贝[初始体质量为（40.79±1.70） g],每个重复30只,试验周期30 d。结果显示：饲料中脂肪含量未显著影响扇贝死亡率（P>0.05）,对照组死亡率显著低于各个饲料处理组（P<0.05）。性腺指数（gonadosomatic index,GSI）随着饲料脂肪含量增加呈先上升后下降的趋势,在F14组GSI达到最高,与对照组差异不显著（P>0.05）,显著高于初始时期（P<0.05）。性腺中雌性部分含水量F10组最高,显著高于F17组（P<0.05）;雄性部分各处理组间差异不显著（P>0.05）。性腺中雌性部分粗脂肪含量显著高于雄性部分（P<0.05）。性腺中脂肪酸的含量PUFA>MUFA>SFA,饲料中脂肪含量显著影响性腺中SFA、MUFA、n-3PUFA、DHA和EPA的含量（P<0.05）,当饲料中脂肪含量为14%或17%时达到最高值。性腺组织切片可见,各个处理组卵母细胞和精原细胞充满整个滤泡腔,滤泡密集,滤泡之间无空隙。由此可得出,配合饲料替代部分单胞藻饲喂海湾扇贝,可使其性腺发育至育苗要求,饲料中脂肪质量分数为14%时可以代替部分单胞藻饲喂海湾扇贝促进性腺发育。     

基于改进生态足迹模型的保定市土地利用的生态安全评价

为保定市土地资源的合理开发利用提供依据,运用生态足迹模型及生态压力指数模型,研究了保定市土地利用的生态安全。结果表明:1)2002-2012年保定市土地利用生态安全水平呈下降趋势,生态压力指数年平均增长率为3.57%,2002-2003年土地利用生态系统的生态安全等级处于很不安全状态,2004年以后处于极不安全状态。经对2012年保定市区及22个县(市)安全等级进行分区,由西部山区到东部平原区的生态安全等级依次为较安全→很不安全→极不安全→较不安全。     

农杆菌介导大豆子叶节系统的两个问题突破

为解决大豆子叶节系统存在的再生和检测问题,对影响丛生芽伸长和植株检测的因素进行研究.以大豆品种黑农35的子叶节为外植体,利用L934正交试验确定影响再生系统丛生芽伸长的因素及水平,将转基因小植株的叶片培养愈伤组织以提取基因组DNA进行Southern检测.结果表明,丛生芽伸长的最佳组合为继代培养基与初始芽诱导培养基的6-BA浓度比为1/5,芽伸长培养基中添加50 mg L-1Glu、0.5 mg L-1 GA3、0.5 mg L-1ZT;Southern杂交信号说明利用叶片培养的愈伤组织能够提取足够量的基因组DNA.     

国内云南高原特色农业研究综述

通过对2012—2017年有关国内云南高原特色农业研究文献的搜集和分析,发现目前国内云南高原特色农业在产量、效益、品质齐增,产业体系初具雏形的同时,又面临着品牌建设滞后、市场开拓缓慢、产业化发展层次低、农业投入机制不完善、生态文明缺失等问题。以因地制宜的品牌规划和全方面的市场拓展为引导,健全公共服务体系和生态文明体系、完善农业人才培育机制、构建重点化和多元化的投入机制是解决这些重大问题的突破口。今后的研究方向主要有云南高原特色农业总体营销战略的研究、加强农产品标准化生产和监督机制的研究、农产品流通体系创新及实证性研究等。     

远志茎愈伤组织无性系建立的研究

为保护野生资源,实现人工栽培,以远志的叶片、嫩茎和嫩根为材料,采用组织培养的方法,进行愈伤组织的诱导和分化,试管苗的生根、移栽和定植的研究,建立远志嫩根无性系。结果表明:MS+BA 0.5 mg/L+2,4-D 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L是嫩根愈伤组织诱导培养和继代培养的理想培养基;MS+BA 0.8 mg/L+NAA 0.1 mg/L+AgNO3 1.8 mg/L和MS+BA 0.8 mg/L+NAA 0.1 mg/L+AgNO3 2.1 mg/L 2种培养基是嫩根愈伤组织分化培养的理想培养基;1/4 MS+NAA 0.2 mg/L是不定芽生根培养和试管苗生根继代培养的理想培养基;定植成活的试管苗保持了野生远志的所有生物学性状。