哈维弧菌rbsB基因的克隆与表达

哈维弧菌(Vibrio harveyi)是海水鱼养殖中一种重要的病原菌。该研究根据已知rbs B(核糖体结合蛋白)基因序列设计引物,扩增得到哈维弧菌354(V.harveyi 354)rbs B基因的全序列(Gen Bank序列号MF797015),预测该序列可编码292个氨基酸,分子量为30.7 k D,理论等电点为5.05,亲水性系数为0.043,为疏水性蛋白。根据Rbs B氨基酸构建的系统进化树可以发现哈维弧菌Rbs B蛋白和欧文弧菌(V.owensii CAIM 1854)的关系最近。构建了p GEX-4t-1-rbs B重组质粒并转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,得到的重组蛋白的相对分子量约59 k D,在37℃、IPTG浓度为0.6 mmol·L–1诱导8 h时表达量最高。     

青蟹呼肠孤病毒和青蟹双顺反子病毒-1双重巢式PCR检测方法的建立

青蟹呼肠孤病毒(mud crab reovirus, MCRV)和青蟹双顺反子病毒-1(mud crab dicistrovirus-1, MCDV-1)是从近年发生大规模死亡的养殖拟穴青蟹体内分离的、对青蟹具有致病性的两种病毒。它们常常同时存在, 给青蟹养殖业带来巨大经济损失。在疾病的防治中, 快速高效的病毒检测方法对疾病诊断以及及时采取有效地防治措施具有重要的意义。本研究利用MCRV和MCDV-1基因保守区设计4对引物, 建立了可同时检测这两种病毒的双重巢式PCR(duplex-nested PCR)检测方法。研究发现该方法对两种病毒的检测限都可以达到10个拷贝, 并与鲍肌肉萎缩病毒(AbSV)、虾类传染性表皮与造血组织坏死症病毒(IHHNV)、大菱鲆红体病虹彩病毒(TRBIV)、对虾白斑综合症病毒(WSSV)、鱼类神经坏死病毒(NNV)和贝类急性病毒性坏死症病毒(AVNV)等水生动物常见病毒均无交叉反应, 可以特异性地检测两种病毒。本方法具有高灵敏度、高特异性和简便快捷等特点, 可作为一种快速诊断工具, 检测拟穴青蟹中的MCRV和MCDV-1基因。

     

番石榴叶水提取物抗对虾白斑综合征 病毒有效成分初探

利用有机萃取技术对番石榴叶水提取物进行了初步分离,得到石油醚相（S）、乙酸乙酯相（Y）,正丁醇相（Z）和水相（W）4个组分。然后通过人工感染试验,确定了各组分抗对虾白斑综合征病毒（WSSV）的效果,并通过体外试验研究了番石榴叶水提取物及各组分对WSSV的影响。人工感染的结果显示：用乙酸乙酯相与正丁醇相这两种组分分别处理WSSV后,对虾在用WSSV人工感染后未出现死亡,而用石油醚组分处理WSSV后,对虾在用WSSV人工感染后第5d开始出现死亡,第12d全部死亡,表明番石榴叶中影响WSSV致病性的有效成分的极性较强,与乙酸乙酯和正丁醇相近。用番石榴叶水提取液及其各萃取组分体外处理WSSV不同时间后,试验组和对照组中的病毒拷贝数随时间推移略有降低,但在第120h结束时,各组中的病毒拷贝数还维持在较高水平;之后,将WSSV核酸暴露,并在体外用番石榴叶水提取物及其各萃取组分处理,荧光定量PCR结果显示：随着孵育时间的延长,各组病毒基因拷贝数无显著性变化。     

养殖密度对克氏原螯虾生长及消化酶、免疫酶活性的影响

密度胁迫会对水生动物的免疫和抗氧化功能等产生负面影响。为提高拟穴青蟹 (Scylla paramamosain) 养殖产量潜力,为其养殖业发展提供理论依据,通过将拟穴青蟹置于8 只·m⁻² (低密度组)、16 只·m⁻² (中密度组)、32 只·m⁻² (高密度组) 3种不同密度条件下养殖72 h,研究了密度对拟穴青蟹抗氧化和免疫能力的影响。抗氧化酶活结果表明：高密度组过氧化氢酶 (CAT) 和超氧化物歧化酶 (SOD) 活性均显著高于低密度和中密度组 (P<0.05),而谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 活性在各组之间无显著性差异;高密度组丙二醛 (MDA) 含量与低密度和中密度组相比显著升高。免疫酶活结果表明,高密度组酸性磷酸酶 (ACP)、碱性磷酸酶 (AKP) 和溶菌酶 (LZM) 活性均显著低于低密度和中密度组 (P<0.05),而中密度组ACP、AKP、LZM活性与低密度组无显著性差异。荧光定量结果显示,高密度组热休克蛋白70基因 (HSP70) 表达水平呈先降低后升高趋势,且在养殖第6—第48小时均显著低于低密度和中密度组 (P<0.05);高密度组Caspase 3基因表达水平在养殖6 h后显著升高,在第24小时达到最高后逐渐下降,但其表达水平始终显著高于低密度组 (P<0.05)。综上,高密度养殖会对拟穴青蟹造成氧化损伤,进而导致其免疫能力下降。16 只·m⁻²的养殖密度对拟穴青蟹抗氧化和免疫能力无显著影响。     

病毒感染后杂色鲍部分血清免疫因子的变化

对杂色鲍(HaliotisdiversicolorReeve)进行病毒悬液和PBS(对照)注射感染,研究其血清免疫因子SOD、ACP、AKP、MPO活性的变化,并对实验结果进行统计学分析。结果表明,(1)注射病毒悬液组SOD活性变化为逐渐上升,至8h后达到最高点,然后逐渐下降;对照组SOD活力呈下降趋势,8h后上升,12h后恢复至初始水平,二者结果差异均为显著或极显著(P<0 05或P<0 01)。(2)注射病毒悬液组ACP与AKP活性的变化为:36h前变化不大,48h后明显上升;对照组ACP和AKP活性变化不大,二者结果除了第48小时外,差异均不显著(P>0 05)。(3)注射病毒悬液组MPO活性在第1小时内上升,然后逐渐下降,第8小时下降到最低点,随后逐渐上升;对照组在第1小时内下降,然后逐渐上升,第12小时升至最高点,然后逐渐下降,48h后与正常鲍活性基本一致。t检验显示,这两组结果在第1、4、8、24、36、48h差异显著或极显著(P<0 05或P<0 01),在第2、12小时差异不显著。结果显示,在人工感染病毒48h内,杂色鲍体内的免疫因子发生了明显的变化,血清中SOD活性降低,ACP及AKP活性显著升高,MPO活性显著升高。     

益生菌对凡纳滨对虾生长和全虾营养组成的影响

研究了芽孢杆菌制剂（Bacillus sp．,10^9CFU·g^-1）对凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei（初始体重0．03g·尾^-1）生长性能、全虾营养成分和氨基酸的影响。7种试验饲料中芽孢杆菌制剂的添加量分别为0,0．5,1．0,1．5,2．0,2．5和3．0g·kg^-1饲料。芽孢杆菌制剂对凡纳滨对虾的成活率没有显著影响。摄食添加益生菌1．0和1．5g·kg^-1饲料的凡纳滨对虾的增重率高并且饲料系数低于对照组,特别是添加量为1．0g·kg^-1时,差异显著;然而,其它添加量并不存在显著性差异。添加益生菌对凡纳滨对虾全虾的水分、蛋白质和灰分含量的影响不显著;投喂添加益生菌1．0和1．5g·kg^-1饲料,脂肪含量高于对照组。饲料中添加益生菌可以改变凡纳滨对虾全虾中部分氨基酸的含量。     

番石榴叶水提取物对拟穴青蟹免疫相关酶活力的影响

采用静水法研究不同浓度番石榴水提取物(guava leaf water-extract,GLWE)对带毒拟穴青蟹(Scylla paramamosain)的成活率及在GLWE质量浓度分别为0(C0,对照组)、10 mg·L~(–1)(C10组)、20 mg·L~(–1)(C20组)、40mg·L~(–1)(C40组)、80 mg·L~(–1)(C80组),用药时间分别为0 h、12 h、24 h、48 h、72 h的条件下对其血清中碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、溶菌酶(LZM)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、酚氧化酶(PO)和一氧化氮合成酶(TNOS、i NOS)活力的影响,并初步探究GLWE的适宜用药浓度范围。结果表明,实验15 d,各处理组青蟹的成活率随着GLWE浓度的增高呈先升后降的现象且与C0组差异显著(P0.05),其中C40组的成活率最高(55.56%),C0组的成活率最低(22.22%)。用药12 h,C80组的AKP、CAT、PO、i NOS活力均显著高于C0组(P0.05);用药24 h,C20和C40组的SOD、LZM及C40组的ACP、CAT和PO活力均显著高于C0组(P0.05);用药48 h,C10、C20组的CAT活力及C40、C80组的TNOS和i NOS活力均显著高于C0组(P0.05);用药72 h,各处理组的AKP活力均显著高于C0组(P0.05),但C40、C80组的ACP和CAT活力显著低于C0组(P0.05)。该条件下,10~40 mg·L~(–1)的GLWE可在48 h内显著促进拟穴青蟹血清AKP、ACP、SOD、CAT、PO、NOS、LZM活力的升高,其中以20~40 mg·L~(–1)GLWE的效果最优。     

拟穴青蟹池塘生态养殖技术

<正>拟穴青蟹生长快、个体大、肉质鲜美、营养价值高,是一种重要的海水养殖蟹。2020年拟穴青蟹养殖产量达15.94万吨,位居海水蟹养殖产量首位。目前拟穴青蟹苗种主要来自于海区野生苗和一些人工繁育苗。养殖户购买苗种后,放入低盐度的池塘中进行粗放式养殖。该养殖模式在人力、物力方面投入少,但养殖产量和经济效益低。蟹苗成活率一般在15%～20%,     

2012年～2014年南海海水养殖鱼类病原菌哈维弧菌分离株的耐药性分析

哈维弧菌(Vibrio harveyi)是海水养殖鱼类主要的病原菌,给养殖业带来了巨大的损失。该研究采用K-B法对南海地区沿岸养殖鱼类90株哈维弧菌分离株进行抗生素耐药性分析,通过系统聚类法以平方Euclidean距离来分析菌株间的耐药性同类关系,探讨哈维弧菌耐药性的时空分布和耐药谱的多样性。结果显示,90株哈维弧菌共有耐药谱26种,谱型丰富度为28.9%。其中,多重耐药谱(耐3类及以上抗生素)21种,包含菌株共35株,占总菌株数的38.9%,谱型丰富度为80.8%。从时间分布上看,2012年、2013年和2014年分别具有10、18和8种耐药谱型;从地区分布上看,海南、广东和广西3个地区分别包含17、13和2种耐药谱型,时间与地区的耐药谱型差异明显。90株哈维弧菌样本聚类分析得到GroupⅠ、GroupⅡ和其他组群,分别含有11、12和4种耐药谱,耐药谱型率分别为16.9%、57.1%和100%,而GroupⅠ和GroupⅡ组群进而分为5个亚群i～v。结果表明,在广东、海南和广西地区养殖鱼类中所分离到的哈维弧菌耐药谱具有复杂多样性特征,随着时间年份的递增,哈维弧菌耐药谱种类也发生着更新变化,耐药谱不断扩大延伸。     

军曹鱼MHC-Ⅱα基因全长cDNA的克隆及其组织表达分析

本研究根据其他鱼类MHC-Ⅱα基因的保守序列设计兼并引物,运用同源克隆和末端快速扩增方法扩增了军曹鱼MHC-Ⅱα基因的全长cDNA序列,并对cDNA及其氨基酸序列进行了分析,比较了军曹鱼和其他物种的MHC-Ⅱα氨基酸序列的差异,分析了军曹鱼MHC-Ⅱα基因的组织分布及经LPS刺激后头肾组织中MHC-Ⅱα基因的表达变化。结果表明,军曹鱼MHC-ⅡαcDNA全长998 bp,包括53 bp的5′末端非编码区(5′UTR)、234 bp的3′末端非编码区(3′UTR)及711 bp的开放阅读框(ORF),编码236个氮基酸,其蛋白质分子质量约为25.94 ku,等电点为4.39;军曹鱼MHC-Ⅱα蛋白质序列具有一些重要的特征,包括前导肽、α1、α2、CP/TM/CYT区和保守的半胱氨酸等;军曹鱼MHC-Ⅱα与鼠、人及其它鱼类的氨基酸同源性在25.0%~69.5%之间。Real-ti me PCR检测结果显示,MHC-Ⅱα基因在正常军曹鱼组织中均有表达,但其表达量在各种组织中存在差异,其中较强表达于头肾、鳃,中等程度表达于脾脏、肠,在心脏、脑、肌肉中表达较弱;经LPS刺激后,头肾中MHC-Ⅱα基因表达下调。