坛紫菜响应高光胁迫的分子机制

坛紫菜（Neoporphyra haitanensis）生活于中高潮区,退潮后会遭受到周期性的强光胁迫,但高潮复水后坛紫菜叶状体可以快速恢复正常生长,表明坛紫菜具有极强的耐高光能力。然而,其耐高光机制尚不明确。为此,本研究挑选了两个耐高光能力具有显著差异的坛紫菜新品系作为研究对象（绿色品系：9-IV;桔色品系：WO141-3）,测定了高光胁迫下两个品系藻体的光合速率、抗氧化酶活性等生理指标,构建了两个品系的差异转录表达谱,并结合荧光定量分析技术获得了调控坛紫菜耐高光的关键通路和基因。具体结果如下：在高光胁迫下,两种坛紫菜品系叶状体的丙二醛含量均显著上升,光系统部分基因表达量显著降低,藻体光合能力显著下降。进一步分析发现,WO141-3品系在高光处理1 h具有更强的高光抗性,而9-IV品系在处理4 h后具有更强的高光抗性,造成这种差异的主要原因是：高光胁迫处理1 h时,WO141-3品系具有更高的活性氧清除能力、更强的非光化学淬灭能力以及更低的色素含量和捕光蛋白基因表达量;而在高光胁迫处理4 h时,9-IV品系的活性氧清除能力和非光化学淬灭能力更强,色素含量和捕光蛋白基因表达量都更低。以上结果说明,坛紫菜藻体可以通过激活非光化学淬灭机制和抗氧化系统,以及降低色素含量和捕光蛋白基因表达应对高光胁迫,避免遭受过度光损伤和氧化损伤。本研究结果为阐明紫菜的耐高光机理奠定了理论基础。     

坛紫菜薄叶新品系选育及经济性状的比较

对坛紫菜人工杂交和选育的Z-26、Z-61和Z-81品系的F2、F3代的经济性状进行比较,旨在选育优良的薄叶新品系。实验结果表明,（1）Z-61新品系藻体薄,厚度约为26～32μm,培养期间经两次剪收,厚度增长不明显,日平均增厚0.32～0.35μm/d;Z-81藻体厚度为36～40μm,比Z-61厚38～50%,剪收后厚度增长明显,日平均增厚0.60～0.70μm/d,经两次剪收后藻体厚度可达52μm;Z-26新品系厚度为30～42μm,剪收后厚度日增长介于Z-61和Z-81新品系之间,为0.37～0.55μm/d;（2）Z-61的F3代在低氮、磷培育液培养8d,藻体虽然发黄但未死亡,移至含有氮、磷的正常培养液中培养2～3d,色泽和生长均可恢复正常;Z-81F3代和Z-26F3代在低氮、磷下生长较Z-61F3代慢,恢复时间需要3～5d;（3）Z-61F2代第1次剪收时的藻胆蛋白含量较Z-26、Z-81品系高30.2%～34.4%,叶绿素a含量比Z-81高13.8%～44.7%。以上研究结果可为选育薄叶型坛紫菜,提高坛紫菜的质量和经济效益奠定基础。     

坛紫菜叶状体RNA提取方法的改良与比较

为提取高质量的坛紫菜叶状体总RNA,对常用的几种植物RNA提取方法(CTAB法、SDS法、异硫氰酸胍法)按照去除多糖、多酚的方法进行了改良,并对分离的总RNA根据吸光值、电泳图谱及RT-PCR检测等结果与两种试剂盒(离心柱试剂盒法,RNAiso法)的提取结果进行了比较。结果表明,SDS法、异硫氰酸胍法和RNAiso法3种方法提取的RNA纯度低,质量差,部分RNA已经发生了降解。而改良CTAB法和离心柱试剂盒法提取的总RNA质量可靠,完整性好,纯度高,并且成功去除了可能影响逆转录酶活性的物质,可以进一步应用于cDNA文库构建,基因表达分析等后续实验,但这两种方法各有优缺点,应根据实际情况选用合适方法进行坛紫菜叶状体总RNA的分离。     

坛紫菜诱变育种的初步研究

近十几年来,坛紫菜品种退化、产量降低、质量下降,本实验通过诱变处理,筛选和培育优质高产的坛紫菜新品系.坛紫菜野生丝状体经一定剂量60Co-γ射线辐照后,子代叶状体发生了变异,经大量培养后筛选出紫色突变体(3号Ⅰ)和经济性状优良的个体(7号Ⅰ和7号Ⅱ),通过体细胞酶解和单克隆技术快速获得诱变选育纯系,并对其主要经济性状进行了研究.其主要特征:[1]7号Ⅰ:叶片宽[(2.99±0.61)cm]、生长快(30cm以上的藻体长度平均日增长量可达6.51cm,比对照组快55.3%)、耐高温(29℃正常生长,比对照组高2℃以上)、总藻胆蛋白含量高(104.86mg·g-1干品,比对照组高39.0%);[2]7号Ⅱ:藻体窄、生长快(30cm以上的藻体长度平均日增长量可达4.26cm,比对照组快58.7%)、叶片薄(藻体中部厚度仅为22.5～27.5μm,比对照组薄29.6%)、总藻胆蛋白含量高达104.24 mg·g-1干品,比对照组高39.4%);[3]3号Ⅰ:藻体紫色,叶片薄,藻体中部厚25.0～32.5μm;[4]7号Ⅰ和7号Ⅱ在生产上应用,产量分别达309.6kg·666.6m-2和291.5kg·666.6m-2,比对照组高37%和29%.     

坛紫菜过氧化氢酶基因的克隆及表达特征

过氧化氢酶(CAT)是植物细胞抗氧化酶的主要成员,在逆境胁迫下的活性氧(ROS)清除中发挥着重要的作用。本研究采用RACE扩增技术克隆获得了坛紫菜CAT基因的全长,被命名为PhCAT(Genbank收录号:KM655303)。该基因全长1983 bp,可编码包含542个氨基酸的多肽,与条斑紫菜CAT基因的序列相似性为83.08%。多序列比对和系统进化树分析结果确认PhCAT属于CAT基因家族。PhCAT基因定量分析结果显示,失水胁迫条件下,PhCAT的基因表达水平只在失水率≥60%时才显著上调;不同时间水平的高温胁迫条件均可诱发PhCAT基因的上调表达。而CAT酶活测定结果却显示,各种水平的失水胁迫条件下,坛紫菜细胞内的CAT酶活水平均显著低于正常条件下的酶活水平;高温胁迫24 h时,CAT酶活水平显著增强,而其余时间点的酶活水平则显著降低。研究表明CAT酶在坛紫菜高温胁迫应答中发挥着重要作用,但在失水胁迫应答中却没有发挥明显作用。     

5.8S rDNA-ITS区片段的序列分析在坛紫菜种质鉴定中的应用

为探讨DNA序列标记技术在坛紫菜种质鉴定中的应用,对10个野生坛紫菜种质材料的5.8S rDNA-ITS区进行PCR扩增和序列分析,结果发现扩增的片段长度在1 208~1 219 bp之间,可以分为ITS1区,5.8S区和ITS2区3个部分,其中5.8S区片段的长度完全一致,均为160 bp;ITS1区和ITS2区片段的长度也非常接近,只有几个碱基的差异。多重序列比对发现10个种质材料的ITS区（包括ITS1和ITS2）序列都存在一定差异,序列同源性在95.82％~99.73％之间,而5.8S区序列则完全一致,但与其它种紫菜的5.8S区序列有很大差异,序列同源性在79.7％~95.0％之间。由此认为5.8S rDNA-ITS区这种高度保守区和高变区交替排列的形式可以成为坛紫菜种质鉴定及系统进化分析的强有力工具。     

野生坛紫菜种群遗传多样性的ISSR分析

采用简单序列重复区间(ISSR)分子标记技术对福建省的3个野生坛紫菜(Porphyrahaitanensis)种群共60个个体进行了遗传多样性分析.15条引物共扩增出222个位点,其中186个位点具有多态性,多态位点百分率为83.78%,在种群水平上,多态位点百分率为80.18%～81.53%,平均为80.93%.期望杂合度、Shannon信息指数在物种水平上分别为0.3304和0.4834;在种群水平上分别为0.3089和0.4551,表明坛紫菜种群内存在着较高的遗传多样性水平,且在三个种群间没有明显差异.依据Gst值,坛紫菜的遗传变异主要发生在种群内的个体间(占93.5%),只有6.5%的遗传变异发生在种群间,由此说明坛紫菜种群间的遗传分化水平很低,这与坛紫菜种群间充分的基因交流(Nm=7.1930)是相关的.基于遗传距离的UPGMA聚类结果表明坛紫菜60个个体并不按照其地理分布进行分群,而是随机分群的.文章最后还对坛紫菜种质资源保护的必要性进行了讨论.     

高温静水胁迫培养对坛紫菜品质的影响

以坛紫菜耐高温型品系Z-61 F4代叶状体为实验材料,野生型坛紫菜（WT）叶状体为对照,研究了常温（21℃）静水和高温（30℃）静水培养不同天数（0、2、4、6、8、10 d）后,坛紫菜藻体中光合色素含量、粗蛋白含量、总氨基酸含量和4种主要呈味游离氨基酸含量等品质指标的变化情况。结果表明,常温静水培养对坛紫菜耐高温型品系的品质没有显著影响,甚至短时间的常温静水培养还有利于提高野生型品系藻体的品质;但高温静水培养会显著降低耐高温型品系和野生型品系的品质,只是耐高温型品系的品质下降速度要慢于野生型。此外,本研究还发现,耐高温型坛紫菜品系还可以通过调节藻体细胞内别藻蓝蛋白（APC）和游离氨基酸的含量来增强自身对高温胁迫的抵抗能力。本研究结果为全面认识坛紫菜的抗逆性机理提供了基础资料,同时也为后续坛紫菜抗逆新品种的选育提供了理论指导。     

坛紫菜转录因子NhbZIP1克隆和功能验证

高温是制约坛紫菜(Neoporphyra haitanensis)产业发展的主要因素之一,阐明坛紫菜高温胁迫应答机理对耐高温品种选育至关重要。人们已分离多个坛紫菜抗逆相关基因,但尚不清楚这些基因的表达调控机制。本研究通过分子生物学和生物信息学技术分离了坛紫菜转录因子NhbZIP1基因。该基因开放阅读框长825 bp,编码274个氨基酸。从开放阅读框推导的氨基酸序列有5个低复杂度区域和1个BRLZ结构。其中,BRLZ是bZIP家族的保守结构域,含有一个α卷曲螺旋结构(121～171aa)。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测发现,NhbZIP1受高温胁迫显著诱导。为进一步阐明NhbZIP1的功能,将其转入莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中。结果显示,高温胁迫下转基因藻株生物量始终高于野生型,且随处理时间增加差异越来越显著。转基因藻株中热激蛋白家族和抗氧化系统相关基因的表达量显著高于野生型。研究表明,NhbZIP1激活下游抗逆基因表达,在坛紫菜应答高温胁迫中发挥重要作用。研究结果有助于阐明bZIP调控坛紫菜响应高温胁迫的分子机制,为耐高温新品种选育提供了基...     

坛紫菜谷胱甘肽过氧化物酶基因的克隆及表达特征

谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)是植物活性氧(ROS)清除酶促系统的重要成员之一,在植物逆境胁迫应答中发挥着重要作用。本研究以坛紫菜(Pyropia haitanensis)为研究材料采用RACE技术克隆获得了一条坛紫菜的GPX全长基因序列,命名为PhGPX(Gen Bank收录号:JX673908)。该基因序列全长1027 bp,包含555 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含184个氨基酸,分子量为19.9 k D,等电点为8.76。多序列比对和系统进化树分析结果表明Ph GPX属于植物GPX基因家族成员。基因表达水平的q PCR分析结果表明Ph GPX基因在坛紫菜叶状体和丝状体世代中的表达水平没有显著差异;高温胁迫不同时间水平下,Ph GPX基因的表达水平呈现为先上调后下调的趋势;不同失水胁迫条件下,Ph GPX基因的表达不受低水平的失水胁迫影响,但可被高水平(40%)的失水胁迫所抑制,且在复水30 min后仍然无法恢复失水胁迫前的水平。由此推测坛紫菜体内的GPX也可能存在多种家族成员,不同的逆境胁迫条件、甚至不同的逆境胁迫水平可能需要不同家族成员的GPX参与ROS的清除和防御。