军曹鱼Hepcidin基因全长cDNA克隆及其组织表达分析

本试验采用同源克隆和末端快速扩增(RACE)的方法,得到714 bp的军曹鱼(Rachycentron canadum) Hepcidin基因全长cDNA序列。该序列包括213 bp的5'末端非编码区(UTR)、228 bp的3'UTR及273 bp的开放阅读框(ORF),编码90个氨基酸,预测其蛋白分子质量约为10.03 ku,等电点为7.54,预测的蛋白包括信号肽、前肽和成熟肽。通过构建Hepcidin氨基酸序列的系统进化树并进行氨基酸同源性比对,结果显示军曹鱼与已知鱼类及哺乳动物Hepcidin氨基酸的同源性在24.4%~85.6%之间。实时荧光定量PCR(quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)检测结果显示Hepcidin基因在正常军曹鱼组织中均表达,但表达量在各个组织中有所不同,其中以肝脏表达量最高。经脂多糖(LPS)和甲醛灭活的鲨鱼弧菌(Vibrio carchariae)刺激后,肝脏、头肾、脾脏中Hepcidin基因表达均上调。     

杂色鲍肌肉萎缩症的组织病理学研究

[目的]阐明杂色鲍肌肉萎缩症的致病机理。[方法]采用组织病理学的方法,以正常样品作为对照,对中国南方患肌肉萎缩症杂色鲍的不同组织进行了病理学观察。[结果]患病杂色鲍腹足、外套膜、鳃、肝胰腺和肠道均呈现不同程度的病理变化,病理特征主要表现为：腹足肌纤维变性、坏死,外套膜上皮脱落,鳃叶肿胀、血细胞浸润,肝细胞脱落、坏死,肠绒毛变短。[结论]此研究描述了杂色鲍肌肉萎缩症的病理变化特征,为弄清其发病机制提供理论依据。     

赤点石斑鱼神经坏死病毒MCP基因原核表达条件优化

[目的]优化赤点石斑鱼神经坏死病毒的主衣壳蛋白（MCP）基因的原核表达条件。[方法]采用RT-PCR技术扩增出赤点石斑鱼神经坏死病毒MCP基因,构建重组表达载体pRSETA-MCP,以其转化大肠杆菌BL21（DE3）plysS,在不同培养基、温度、pH值条件下进行诱导表达。[结果]重组菌在SOB和LB培养基、pH值7.0、37℃条件下表达量最高,所得的融合蛋白分子量约为44.5 kD。[结论]该研究为RGNNV-MCP疫苗研制奠定了基础。     

卵形鲳鲹美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的分离鉴定

2006年海南省凌水网箱养殖卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)出现大批死亡。肉眼观察病鱼体表完好,部分病鱼内脏稍肿大,病理组织研究显示脾脏和肝脏有灰白色结节。从病鱼的脾脏分离到1株明显优势菌,命名为TOS1,人工感染确认TOS1对卵形鲳鲹有强致病性,其半数致死量为1.1×106CFU/g,组织病理研究显示相同症状,因此确定TOS1为本次流行病的病原菌。经API鉴定系统和16SrDNA序列分析结合常规生化指标,将TOS1鉴定为美人鱼发光杆菌杀鱼亚种(Photobacterium damselae subsp.piscicida)。该菌具有很强的溶血性和较强的蛋白酶活性,对多种抗生素和中草药均具抗性,仅对诺氟沙星、环丙沙星、氯霉素、庆大霉素等敏感,对中草药番石榴(Psidium guajava)和苍术(Atractylodes lancea)高度敏感。以上敏感药物可作为该病预防或治疗的参考用药。     

军曹鱼Ig μ重链的全长克隆及在各组织中的定量分析

采用同源克隆和RACE技术,克隆了军曹鱼Igμ重链的cDNA全序列,并通过荧光定量技术分析其在组织中的表达。军曹鱼Igμ的cDNA全长1933bp,3的非编码区域(UTR)为164bp,5UTR为26bp,开放阅读框为1743bp,编码580个氨基酸,分子量为64.831ku,理论等电点6.6。推测的军曹鱼Igμ全长氨基酸序列与已报道的鱼类的相似性最高为60%,最低为30%,同两栖类的相似度在30%~33%,同其他高等的动物相似度不足30%。较保守的CH4区和鱼类相似性在64%~71%,同其他生物的相似度仅为31%~33%,具有较强的物种特异性。军曹鱼Igμ中存在半胱氨酸和色氨酸的保守位点以及FR2骨架区的GKGLEW和在FR3的YYCAR保守序列。Igμ链基因在健康鱼体中除了肾以外在其它各组织中均有表达,在肠中的表达量最高。经鲨鱼弧菌刺激48、96、192h后,在采样的各个组织中均有表达,心脏、鳃、肠道在刺激后48h表达量明显增加,脾脏、胃和脑0h时的表达量较高,肝脏、头肾以及肾脏192h后表达较显著。从时间上看,黏膜免疫屏障最先抵御外来抗原,其后,依次是肝脏、肾、头肾产生免疫应答,说明系统免疫在长时间的抵御外来抗原时发挥着重要作用。     

海水养殖鱼哈维弧菌分离株的耐药谱型分析

为了解和分析南海沿岸地区临床分离的哈维弧菌(Vibrio harveyi)菌株耐药谱多样性,采用K-B法对84株哈维弧菌分离株进行了12种抗生素的敏感性实验,并通过聚类分析对分离菌株耐药性进行研究,探讨其抗生素耐药性同菌株时空分布的关系。实验结果显示,84株哈维弧菌的耐药谱型数量为26种,谱型丰富度为31.0%;多重耐药谱型数量(耐药种数3种以上)为13种,占总耐药谱型数量的50.0%,谱型丰富度达59.1%。海南、广东、广西、福建的分离株分别包含有18种、15种、3种、1种耐药谱型,4个地区均具有J型(FUR/AMO)耐药谱;2007―2012年各年份菌株耐药谱型为:2007年2种(J、M,耐2种抗生素)、2010年4种(A、B、J、M,耐5种抗生素)、2011年24种(除Y、Z外的A-X耐药谱型,耐7种抗生素),2012年26种(包括Y、Z耐药谱型,耐8种抗生素)。聚类分析将实验菌株分为i~vi共6个亚群,进而聚类为Group I、Group II两个组群;各亚群菌株具有独特的耐药谱型,耐药谱型分别是N、P、T、U、Y(i亚群),R、S(ii亚群),K、P(iii亚群),F、H、O、X、V、W(iv亚群),E、G、Q(v亚群),C、L、Z(vi亚群);两个组群菌株没有共同的耐药谱型。研究结果表明,哈维弧菌分离株耐药谱型多样,谱型丰富度较高,来源不同的菌株耐药谱型存在差异,聚类分析方法能够根据耐药性情况有效地对菌株分型。     

诺卡氏菌mce1A基因的克隆及重组表达

诺卡氏菌(Nocardia seriolae)是近年来海淡水养殖鱼类频发慢性传染病的病原菌。该研究通过引物扩增得到全长1 254 bp、编码417个氨基酸的诺卡氏菌毒力因子mce1A基因的全序列。该基因编码蛋白质的分子量约为43.98 k D,理论等电点5.14,含有161个疏水性氨基酸,疏水性平均值为0.044,为疏水性蛋白,具有α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲3种结构。经预测,Mce1A有MCE、DUF3407区域、OM_asym_Mla D、Mtu_fam_mce、Mla D 5个结构域,彼此交叠,含有公共区域。根据Mce1A氨基酸构建的系统进化树可以发现诺卡氏菌和新星诺卡氏菌的亲缘关系最近。构建p ET32a-mce1A重组质粒并转化至大肠埃希菌BL21中,得到的重组蛋白的相对分子量约63 k D。温度、IPTG浓度对重组蛋白表达量没有影响。该研究为进一步研究Mce1A的致病机制奠定了基础。     

饲料中添加半乳低聚糖对军曹鱼生长、部分血清免疫和生化因子的影响

以添加0、0．2％、0．4％、0．8％和1．6％半乳低聚糖（GOS）的饲料投喂军曹鱼（Rachycentron canadum）8周,研究GOS对军曹鱼生长、部分血清免疫和生化因子的影响。当饲料中GOS的添加水平低于0．4％时能促进军曹鱼生长,但影响不显著（P〉0．05）。在饲料中添加适当水平的GOS对军曹鱼血清溶菌酶和超氧化物歧化酶（SOD）活性有显著的促进作用,而对过氧化氢酶（CAT）活性有显著的抑制作用。GOS对军曹鱼血清生化因子如总蛋白、白蛋白、球蛋白、总胆红素和直接胆红素的浓度有显著影响,对间接胆红素的影响不显著;只有GOS为0．2％的试验组血清总胆固醇浓度显著高于对照组,而0．4％的试验组血清天门冬氨酸氨基转移酶（AST）浓度显著低于对照组;当添加量低于0．8％时,碱性磷酸酶（AKP）活性随饲料中GOS含量增加而降低。结果表明,在饲料中添加适当水平的GOS有利于军曹鱼的生长,并且能够改善军曹鱼的免疫功能和健康状况,其最佳添加量为0．2％～0．4％。     

杂色鲍肌肉萎缩症病原菌的分离鉴定及系统发育分析

近几年中国南方杂色鲍（Haliotis diversicolorReeve）养殖场频繁爆发严重的肌肉萎缩症,该病能感染各种规格杂色鲍,死亡率很高。病鲍症状主要表现为外套膜和内脏团萎缩、无生气,附着力下降,最终死亡。该试验从病鲍组织分离到1株优势菌WS,人工感染试验证实其对健康杂色鲍有很强致病性,且与自然发病的杂色鲍症状相同。对菌株WS进行形态学观察和生理生化检测,结果显示与哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）最为接近。为了进一步确定其分类地位,采用1对通用引物扩增其16S rDNA序列片断进行序列分析和同源性对比,构建系统发育树,结果表明,菌株WS与弧菌属的V.harveyi[AY750577]聚为1个分支,且同源性达99.70%。综合上述3种鉴定结果,确定该菌为哈维氏弧菌。