天津市周边地区养殖凡纳滨对虾肠道菌株的分离鉴定及耐药性分析

随着抗生素在水产养殖业中的普遍应用,细菌耐药性成为环境和食品安全的主要问题。本文旨在通过对天津地区养殖凡纳滨对虾体内细菌的耐药信息进行分析统计,为凡纳滨对虾养殖业的疾病控制和提高水产品安全性提供理论指导。本研究对天津市津南区、汉沽区及西青区等对虾养殖基地取样的凡纳滨对虾进行肠道微生物的分离培养,抗生素药敏实验以及抗生素抗性基因的检测。共获得菌株1 219株,选取其中有代表性的215株菌株进行鉴定,结果显示,所鉴定菌株属于56种不同种属,主要以芽孢杆菌、副溶血性弧菌、葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、席罗弧菌、溶藻弧菌、格氏乳球菌、希瓦氏菌、霍氏肠杆菌、库特氏菌、施氏假单胞菌、荚膜红细菌、液化沙雷氏菌、不动杆菌、假单胞菌、假交替单胞菌及霍乱弧菌等为主。所鉴定菌株的抗生素药敏实验分析结果发现,凡纳滨对虾肠道微生物普遍存在抗生素抗性,其中β-内酰胺类的氨苄西林、糖肽类的杆菌肽、喹诺酮类的罗美沙星和磺胺类的磺胺抗药性最为明显。因此本文进一步对其中耐药种类较多且耐药性较强的82株细菌对四大类抗生素(链霉素类、磺胺类、四环素类和青霉素类)的抗性基因(str A-str B,sul II,sul II,sul III,tet A,tet C,tet G,blao XA-1,bla PSE-1,bla TEM)以及整合子(in T1和in T2)携带情况进行检测。研究结果表明,所检测耐药菌株均携带抗性基因,其中磺胺类抗性基因的检出率最高,可达63%,其次是青霉素类抗性基因,检出率为61.4%,整合子基因平均检出率为42.1%,四环素类相对较少为35.4%,且四环素类只检测出tet A抗性基因,其中67.1%的菌株存在多种耐药基因。     

浅谈我国海水养殖标准化的现状及发展途径

我国海水养殖经历了以海带养殖、对虾养殖和扇贝养殖为代表的三次养殖热潮后,在短短几十年间迅速成为渔业经济的支柱产业。但由于海水养殖业历史较短,生产经验较少,基础研究薄弱,因此,海水养殖标准化工作也相对薄弱。据2003年水产行业标准体系的评估,我国现行海水养殖标准数量还不到应有标准数量的5%,这还不包括与海水养殖相关的渔用饲料专业、水产品加工专业、水生动物防疫专业的标准。现行标准中也有部分标准标龄较长,技术陈旧落后,已不适应当前养殖生产需要。急需投入大量的物力、财力和精力,进行深入的基础性研究,迅速制定海水养殖所急…     

中华绒螯蟹野生群体和不同水系人工选育群体的遗传多样性分析

本研究利用10个微卫星分子标记分析了中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis) 3个不同水系人工选育群体(“长江1号”、“光合1号”和七里海河蟹)和1个海河流域自然群体的遗传多样性和遗传分化水平。结果显示,10个位点在4个群体中的等位基因数(N)为3~17,平均等位基因数为8.5~9.7,平均期望杂合度为0.720~0.745,平均观测杂合度为0.566~0.661,平均多态信息含量为0.687~0.716,近交系数(Fis)范围为–0.080~0.827。在40个群体–位点组合中,有13个群体–位点组合显著偏离哈迪–温伯格平衡(P<0.05)。遗传多样性分析结果显示,与海河自然群体相比,3个人工选育群体遗传多样性水平略有降低,但仍保持在较高水平,具有较大的选育潜力。遗传分化分析结果显示,群体间遗传分化指数(Fst)范围为0.015~0.075,遗传相似度为0.7702~0.9401,遗传距离为0.0617~0.2611。基于Nei’s遗传距离构建了群体UPGMA系统进化树,自然群体和“光合1号”聚为一支,而七里海河蟹群体单独聚为一支。综上所述,4个中华绒螯蟹群体间的遗传分化水平较低,群体遗传多样性较高。本研究将为中华绒螯蟹选育繁育和种质资源利用与管理等提供理论基础。     

中国对虾清水育苗实验

针对中国对虾育苗用水处理关键技术,结合育苗生产单位实际条件,设计3种不同育苗用水处理模式:(1)天然海水三级沉淀净化(简称肥水),(2)沉淀海水再消毒砂滤净化(筒称清水),(3)高盐水兑淡水,应用产卵高峰同批优质受精卵开展育苗对比实验研究.结果表明:清水育苗效果最好,肥水育苗效果其次,高盐水兑淡水育苗效果最差.为中国对...     

凡纳滨对虾丝氨酸蛋白酶同源物基因 (Lv-SPH)的克隆及免疫应答特征

【目的】丝氨酸蛋白酶（serine protease, SP）是一类重要且分布广泛的蛋白水解酶,行使着一系列重要的生理功能,包括参与消化作用、血液凝结、胚胎发育和免疫应答过程等,但在甲壳动物中少见初步报道。对虾的养殖持续面临着病害的困扰,深入开展对虾免疫防御机制研究,将会为寻找抗病新思路提供借鉴。【方法】本研究利用RACE技术克隆获得了一个新的凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）丝氨酸蛋白酶同源物（Serine protease homologs, SPHs）基因（Lv-SPH）的全长cDNA序列,通过生物信息学方法分析了其序列特点,并利用实时荧光定量PCR方法探讨了其组织分布特征和应答病毒感染的表达变化模式。【结果】生物信息学分析显示该基因全长1 249 bp,ORF区长1 005 bp,5’-UTR为156 bp,3’-UTR为88 bp,ORF区编码334个氨基酸,氨基端的16个氨基酸为预测的信号肽序列。在线分析软件SMART分析显示Lv-SPH蛋白含有一个Clip结构域和一个高度保守的SP结构域（Tryp-SPc）,后者具有三分子活性催化位点,前两个是组氨酸和天冬氨酸,第三位为甘氨酸。该基因在凡纳滨对虾各种组织中有不同程度的表达,其中在血细胞中表达量最高,在肝胰腺、心脏和肠道中广泛表达,而在肌肉中表达量最低。注射白斑综合征病毒（White spot syndrome virus, WSSV）后24h时,Lv-SPH基因的相对表达量显著升高,病毒感染后48h达到最高,约为对照组的3倍。【结论】Lv-SPH基因具备典型的SPH家族成员特征,具有一定的组织表达特异性,WSSV可以显著诱导该基因的上调表达,表明它可能参与了WSSV引发的凡纳滨对虾免疫应答过程。【意义】研究结果为深入探讨对虾天然免疫调控机制提供了参考,在对虾健康养殖及病害防治方面具有潜在的应用价值。     

凡纳滨对虾血细胞图像流式检测与病原感染分析

血细胞是机体免疫系统的核心,为了对其进行精细的类群划分和功能分析,了解动物免疫防御的机制,实验以体质量为17～23 g的凡纳滨对虾为对象,分别根据显微观察的胞内可辨颗粒结构和流式测量的细胞侧向散射特征探讨了其血淋巴的细胞类群,并进一步探讨了在副溶血性弧菌和白斑综合征病毒两种病原感染早期,主要响应的血细胞类群及其数量变化等特征。结果显示,两种方法都能从凡纳滨对虾血淋巴中辨识出无颗粒、小颗粒、中颗粒以及大颗粒四种血细胞,其中无颗粒细胞占比都接近70%,另外3种颗粒细胞合计占比均为30%左右,但细分比例统计有差异。脂质染料DID显示胞内颗粒普遍被膜,中颗粒和大颗粒细胞内的颗粒大小较均匀,提示了其内源性的形成机制;大颗粒细胞大小分布区间最窄且充满颗粒,表明其可能处于发育终末阶段,功能与分泌相关。通过测量发现,在两种病原感染早期,承担吞噬功能的无颗粒细胞和小颗粒细胞是主要响应类群,总体趋势均表现为细胞计数先降后升,推测感染后大量血细胞由于被用于清除病原而导致短时间内损失较多。副溶血性弧菌感染24 h后细胞总数降至低点,而白斑综合征病毒感染后的低点出现在36～48 h,相较略有延后并持续较长时间,...     

中华绒螯蟹高血糖激素基因的克隆和分子结构解析

为深入研究中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）高血糖激素（Crustacean Hyperglycemic Hormone, CHH）基因的结构与功能,我们首次从中华绒螯蟹眼柄中克隆得到高血糖激素基因的全长cDNA序列（Ers-CHH, GenBank 注册号：JX485664）。序列及分子结构分析结果显示：Ers-CHH基因全长585bp,ORF区为 453bp,编码150 个氨基酸,N端30个氨基酸为预测的信号肽区域,其后为42个氨基酸的前体相关肽和78 个氨基酸的成熟肽。其成熟肽区具有典型的CHH家族结构域,包括3个二硫键C7-C43、C23-C39 、C26-C52和4个α螺旋（alpha-helix）,但不具有β折叠结构（beta-sheet）。Ers-CHH成熟肽氨基酸序列与溪蟹（Ptychognathus pusillus）相比有92%的相似性;其三维结构与其它物种CHH三维结构比较结果显示,4个α螺旋所处的位置及所含氨基酸的相似性较高。与中华绒螯蟹MIH相比,CHH序列前段缺少一个螺旋,但其4个α螺旋的位置及氨基酸数目与MIH的α2-α5螺旋高度一致,空间结构也基本相同,这可能是两种激素功能部分重叠的分子基础。上述结果为进一步研究CHH在中华绒螯蟹生长发育及能量代谢过程中的调节机制和人工控制甲壳动物生长代谢提供了重要信息。     

一种凡纳滨对虾新的C型凝集素基因(LvLc2)的克隆及免疫应答特征

为有效地进行凡纳滨对虾病害防治和健康养殖,探究对虾天然免疫机制,为其免疫防控提供新思路,实验根据本课题组前期转录组结果提示,在凡纳滨对虾血细胞中克隆获得了一个新的C型凝集素基因(LvLc2,GenBank登录号KR020738).生物信息学分析显示,LvLc2的ORF区全长465 bp,编码154个氨基酸(aa),5'...     

凡纳滨对虾丝氨酸蛋白酶基因(Lv-SP)的克隆及表达分析

[目的]研究丝氨酸蛋白酶基因(Lv-SP)在凡纳滨对虾天然免疫应答过程中的作用。[方法]利用PCR技术克隆凡纳滨对虾丝氨酸蛋白酶基因(Lv-SP),并进行生物信息学分析,进一步通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法对其进行组织表达分析以及白斑杆状病毒(WSSV)刺激后的表达变化分析。[结果]成功从凡纳滨对虾体内克隆了Lv-SP基因的开放阅读框ORF,碱基数为1 104 bp,共编码367个氨基酸,在线分析软件预测其蛋白分子量为41 k D,等电点PI为6.93;在线分析软件预测显示:Lv-SP基因预测的氨基酸序列保守性很高,含有1个clip结构域和1个高度保守的SP结构域(Tryp-SPc);系统进化发生分析表明:Lv-SP氨基酸序列与中国明对虾以及中华绒螯蟹的丝氨酸蛋白酶(SP)同源性较高,而与按蚊、小蜂窝甲虫的SP同源性较低;qRT-PCR分析结果显示:Lv-SP基因在凡纳滨对虾不同组织中均有表达,并且在鳃和血中表达量较高,而在心和肝中表达量较低,病毒WSSV刺激后,Lv-SP基因在48.0 h和72.0 h有显著的上调表达趋势。[结论]Lv-SP基因保守性比较高,并且其在一定程度上参与了对虾应答病毒侵染的免疫反应,推测它有可能作为重要的免疫调控基因在对虾的防御应答过程中发挥作用。