Ⅰ群禽腺病毒血清4型TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为储备禽腺病毒病疫情防控技术,应用DNAStar软件分析GenBank中Ⅰ群禽腺病毒血清4型(FAdV-4)全基因序列,选取Hexon基因的保守区域设计合成1对PCR引物和1条TaqMan探针,建立FAdV-4 FQ-PCR检测方法,得到相应的标准曲线,并应用该方法对临床病例和人工感染动物进行FAdV-4核酸检测。结果表明,建立的FAdV-4 FQ-PCR方法具有良好的敏感性、特异性、稳定性和临床应用性。     

PRRSV、CSFV混合感染病例的实验室诊断

为确诊贵阳市某猪场疑似猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)死亡病例,对死亡猪进行剖检及实验室诊断。病理剖检可见,病死猪出现淋巴结肿大充血、肺部有坏死灶、胸腔有大量积液等病理变化;同时采集病理组织应用分子生物学和细菌学方法进行PRRSV(普通毒株和Nsp2变异毒株)、猪瘟病毒核酸检测和细菌分离鉴定。结果显示:该病例为PRRSV(普通毒株)、CSFV混合感染所致。     

牛支原体vspY基因克隆及序列分析研究

通过对牛支原体vspY蛋白基因的扩增、克隆及序列分析,研究vspY蛋白基因的保守性。结果:扩增vspY基因片段长度约为1 121 bp,vspY基因克隆测序显示基因片段确定为1 121 bp,与引物设计扩增长度相符;vspY基因序列分析显示,与牛支原体参考株基因同源性为98%,仅在533、728位点存在点突变;系统进化树显示,牛支原体贵州分离株与参考株处于不同系统进化分支,存在一定进化距离。结果表明:牛支原体vspY蛋白基因相对保守,不同地区分离株存在一定进化关系。     

贵阳市散养奶牛牛奶中沙门氏菌的分离鉴定与耐药性分析

为了解贵阳市散养奶牛牛奶中沙门氏菌的污染及耐药情况,采集散养奶牛牛奶样本26份,运用细菌分离培养技术对样本进行细菌分离;PCR鉴定后测序;细菌药敏试验。结果:共分离鉴定沙门氏菌3株,分离率为11.5%(3/26);3株沙门氏菌对庆大霉素(GEN)、卡那霉素(KAN)、阿莫西林(AMC)等耐药,对四环素(TET)、环丙沙星(CIP)、恩诺沙星(ENR)等较为敏感。     

鸡卡氏杆菌GZ2017株的分离与16 S rRNA序列分析

对贵州省某白羽蛋鸡养殖场患病鸡进行临床和实验室诊断,以期明确病因,有效控制感染。通过病理剖检观察、分离培养、染色镜检、生化试验和16SrRNA序列分析等方法对分离菌株进行鉴定。结果显示,该分离菌的培养特性、菌体形态特征、生理生化特征均与文献报道的卡氏杆菌相同。药敏试验结果表明,该分离菌株对米诺环素和万古霉素极度敏感,对多西环素和头孢哌酮高度敏感。16SrRNA序列分析结果显示,该分离菌与鸡卡氏杆菌(Gallibacterium anatis)同源性最高,在98.6%~99.2%之间,遗传进化树结果表明分离菌与Gallibacterium属的细菌同属于一个分支,与日本分离菌株在同一小分支上,属于鸡卡氏杆菌。本试验成功分离到1株鸡卡氏杆菌,并将其命名为GZ2017,试验结果为鸡卡氏杆菌病的治疗与防控提供理论依据。     

贵州省畜禽源葡萄球菌和链球菌快速鉴定双重PCR方法的建立及应用

为建立一种可准确、快速鉴定畜禽临床病例常见病原葡萄球菌和链球菌的双重PCR方法,本试验选取葡萄球菌的nuc基因和链球菌的EF-TU基因保守片段分别设计合成了1对特异性引物,构建可同时快速鉴别葡萄球菌和链球菌的双重PCR体系,并进行反应条件优化,筛选出最佳引物浓度和退火温度;应用该方法对其他73株革兰氏阳性临床分离细菌进行检测,评价该方法的特异性;将培养的葡萄球菌和链球菌倍比稀释计数后鉴定检测方法的敏感性;应用该检测方法对贵州省部分畜禽葡萄球菌和链球菌临床分离样本进行检测。结果显示,所建立的方法最佳引物添加量均为1μL,最佳退火温度为56℃;其他73株供试菌株检测结果均无扩增条带出现,所建双重PCR方法具有较好的特异性;敏感性试验结果显示,葡萄球菌和链球菌敏感度分别达1.50 ng/μL和1.44 pg/μL;临床样本复检结果显示,73株临床分离细菌中葡萄球菌40株(54.79%)、链球菌33株(45.21%),与传统细菌分离鉴定方法的符合率为97.26%。本试验建立了一种特异、敏感和快速鉴定贵州省畜禽葡萄球菌和链球菌病原的双重PCR方法,为临床病例快速诊断及流行病学调查提供了有效技术。     

PRRS不同疫苗组合对仔猪血清抗体水平和CD3、CD4、CD8分子表达量的影响

为了探究猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)不同疫苗组合对仔猪血清抗体水平和CD3、CD4、CD8分子表达量的影响,试验于规模化猪场筛选健康未免疫的仔猪30头,随机分为3个组。其中试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和对照组均在仔猪14日龄首次免疫经典猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)弱毒疫苗,试验Ⅰ组仔猪在35日龄加强免疫高致病性PRRSV灭活疫苗,试验Ⅱ组仔猪在35日龄加强免疫经典PRRSV弱毒疫苗,对照组在14,35日龄均注射0.9%Na Cl溶液,然后对各组仔猪在不同时间点通过前腔静脉采血,应用ELISA法检测血清中PRRSV抗体和CD3、CD4、CD8分子表达量。结果表明:除了CD8分子外,试验Ⅰ组和试验Ⅱ组抗体水平和CD3、CD4分子表达量在部分时间点显著或极显著(P0.05或P0.01)高于对照组,但两个试验组之间无统计学差异。说明在生产实践中PRRSV弱毒疫苗和灭活疫苗联合使用能产生一定的效果,从安全角度考虑,建议采用经典弱毒疫苗结合高致病性灭活疫苗进行免疫。     

道真县兔场兔球虫感染情况调查

为掌握道真仡佬族苗族自治县兔场兔球虫感染情况,采用饱和盐水漂浮法和麦克马斯特虫卵计数法,对县域内2个兔场采集的77份不同年龄段兔新鲜粪便中兔球虫感染情况进行调查,利用PCR技术对兔球虫阳性粪便进行感染种类鉴定分析。结果表明：2个兔场兔球虫总感染率达71.4%,各年龄段兔均有不同程度的感染,以1～3月龄幼兔感染率最高,达96.9%,且多呈中度或重度感染。2个兔场感染的兔球虫主要是穿孔艾美耳球虫、维氏艾美耳球虫和大型艾美耳球虫,且均为混合感染。     

鸭源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及耐药性分析

为鉴定临床疑似鸭多杀性巴氏杆菌感染肉鸭的病原菌,本试验通过细菌分离培养、菌体形态观察、细菌生化鉴定、16S rRNA基因测序分析、细菌种特异性鉴定、荚膜分型鉴定和动物回归试验进行鉴定,并通过药敏试验和耐药基因检测进行耐药性分析。结果显示,从患病鸭肝脏组织分离到的细菌在鲜血琼脂培养基中呈现表面光滑凸起、灰白色菌落,为革兰氏阴性短小杆菌,瑞氏染色呈两极浓染;生化鉴定结果显示,分离菌能发酵葡萄糖、蔗糖和甘露醇,硫化氢、氧化酶和吲哚等试验阳性;16S rRNA基因序列系统进化树分析显示,该分离菌与多杀性巴氏杆菌聚为一支,同源性 > 99%;细菌种特异性鉴定结果与多杀性巴氏杆菌相符;荚膜分型鉴定结果仅扩增到约为1 050 bp的目的基因片段,与荚膜血清A型相符;动物回归试验显示,该分离菌有较强的致病性;药敏试验结果显示,该分离菌对羧苄西林、氨苄西林、复方新诺明和四环素等12种药物耐药;经耐药基因PCR检测显示,该分离菌携带Sul1、Sul3、tet（X）和Intl1 4种耐药基因,与药敏表型相符。本试验成功分离到1株鸭源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌,为鸭多杀性巴氏杆菌病的防治提供参考依据。