鸭IL-1β基因实时荧光定量PCR方法的建立及初步应用

为了建立鸭白细胞介素-1β(IL-1β)基因的实时荧光定量PCR检测方法,并检测鸭机体器官/组织中IL-1β基因转录水平,试验根据GenBank上鸭IL-1β基因序列设计特异性引物,以鸭IL-1β基因克隆质粒为模板,SYBR GreenⅠ为荧光染料,建立鸭IL-1β基因实时荧光定量PCR检测方法,并用该方法检测鸭机体器官/组织中IL-1β基因的转录水平。结果表明:建立的鸭IL-1β基因实时荧光定量PCR方法的熔解曲线为特异性单峰,标准曲线方程为y=-3. 329x+39. 731,扩增效率为99. 7%,相关系数为1,批内重复变异系数小于1. 00%,批间重复变异系数小于2. 00%;实时荧光定量PCR方法的检测敏感性是普通PCR方法检测敏感性的1 000倍;以该方法进行检测发现,鸭的法氏囊、肺脏、肝脏、肌肉、脑、脾脏、肾脏、十二指肠、心脏和胸腺中IL-1β基因mRNA含量分别为428. 45,973. 43,1 394. 19,568. 22,551. 54,839. 91,2 586. 22,1 161. 92,459. 17,3 276. 16 copies/μL,其中胸腺中含量最高,而法氏囊中含量最低。说明试验建立的鸭IL-1β基因实时荧光定量PCR检测方法具有重复性好和敏感性高等特点,可用于鸭机体器官/组织中IL-1β基因转录水平的检测分析。     

禽白血病病毒贵州流行株env基因克隆与序列分析

为了解禽白血病病毒（ALV）贵州流行株的遗传变异情况及分子特征,本试验基于ALV env基因设计合成引物对禽白血病贵州临床病例进行目的基因扩增、克隆和序列分析。结果显示,从临床病例中筛选获得3份阳性样本,PCR扩增均获得大小约921 bp的目的基因片段,将其命名为：GZ-ALV-1株、GZ-ALV-2株和GZ-ALV-3株。序列分析结果显示,3株ALV贵州流行株之间核苷酸同源性在97.2%~97.6%之间,与国内外ALV-J的同源性相对较高,为93.1%~99.3%;而与A、B、C、D、E、K亚群ALV同源性仅为51.4%~53.2%。系统进化分析显示,3株ALV贵州流行株与ALV-J亚群参考株处于同一分支,表明本试验所检测的ALV毒株均为ALV-J亚群;与A、B、C、D、E、K亚群处于不同进化分支。基因变异分析显示,3株流行株37处相同核苷酸变异导致17处氨基酸发生位点变异,其中9个可变点在高变区hr1和hr2,1个可变点在低变区vr3。结果表明,3株ALV贵州流行株均为ALV-J亚群,env基因存在位点发生了变异,且可变位点位于序列高变区。本研究结果为明确贵州禽白血病流行概况及ALV的防控与净化提供基础数据。     

鲤源嗜水气单胞菌分离鉴定、耐药性及毒力基因检测

为查明贵州某鲤鱼养殖厂鲤鱼死亡的病因,本试验进行了细菌分离培养、菌体形态观察、细菌生理生化鉴定、16S rRNA基因测序分析、药敏试验、耐药基因检测、动物感染试验、毒力基因检测等。结果显示,从死亡鲤鱼病变组织中分离到的细菌呈圆形凸起、表面光滑的灰白色菌落,为革兰氏阴性短杆菌;生化鉴定结果显示,分离菌具有运动性,能发酵葡萄糖产酸产气,精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、M-R和V-P试验阳性;应用细菌16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增获得大小为1 421 bp的片段,测序发现,该分离菌与16株嗜水气单胞菌相应序列同源性达75.3%～100.0%;药敏试验结果显示,该分离菌对氟苯尼考、头孢曲松、妥布霉素、氧氟沙星、恩诺沙星5种药物呈现高度敏感,对复方新诺明、磺胺异噁唑、羧苄西林等药物呈现耐药,经耐药基因PCR检测显示,该分离菌携带Sul1、Sul2和Intl1 3种耐药基因,与药敏表型相符;人工感染试验显示,该分离菌有致病力,经毒力基因检测显示,该分离菌携带aer、hly和act 3种毒力基因。上述试验结果表明,本研究分离得到了一株耐磺胺类药物的鲤源嗜水气单胞菌,为该鲤鱼养殖厂的鲤鱼疾病防治与合理用药提供了科学依据。     

杂交鲟类志贺邻单胞菌的分离鉴定及耐药性分析

试验旨在对鲟体内分离菌进行鉴定、致病力探究和耐药性分析。本研究从濒死鲟体内分离到1株细菌（NZ-2017）,通过形态学观察、生理生化特性鉴定、16S rRNA基因分析及系统进化树构建等方法对分离菌种属进行确定,并采用纸片扩散法进行药敏试验,PCR方法检测耐药基因,人工感染小鼠试验确定分离菌的致病力。结果显示,NZ-2017为革兰氏阴性杆菌,其16S rRNA基因经测序及BLAST比对,显示其与类志贺邻单胞菌的同源性达99.70%,结合生理生化鉴定结果确定分离菌为类志贺邻单胞菌。药敏试验结果显示,分离菌对氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、多西环素4种药物敏感,对卡那霉素、阿莫西林、泰乐菌素、复方新诺明4种药物耐药;5种耐药基因检测结果显示,该菌携带3种耐药基因：Sul1、Sul2和Intl1,与药敏表型相符。人工感染试验结果显示,该菌对小鼠有致病力。本研究对贵州地区鲟发病流行的病因作出了准确诊断,为该地区细菌性鱼病预防和合理用药提供依据。     

敲除小RNA gcvB后沙门菌的转录组分析

为筛选与沙门菌小RNA gcvB相关的靶基因,采用高通量的转录组测序(RNA-seq)技术对野生型沙门菌和敲除小RNA gcvB沙门菌的mRNA进行对比分析,全面地预测GcvB的靶基因的数量与种类,通过GO和KEGG数据库对筛选基因进行比对注释,进一步分析筛选基因的主要功能及涉及的生物过程。并利用荧光定量PCR对部分差异表达基因进行验证。结果显示:差异表达基因共1 244个,其中基因表达上调678个,基因表达下调566个。GO富集分析显示,差异表达基因主要涉及氧化还原活性、铁离子结合、运动活性等分子功能,细菌鞭毛的细胞成分,细胞呼吸、钴胺素代谢过程和钴胺素生物合成过程等生物过程。KEGG数据库分析显示,差异表达基因主要参与细菌趋化性、卟啉和叶绿素代谢、不同环境中的微生物代谢、双组分系统、甲烷代谢等14个信号通路。对筛选出的10个差异表达基因进行荧光定量PCR验证,结果显示:差异表达基因相对表达量与RNA-seq测序结果基本一致。本研究为进一步探明小RNA gcvB与靶基因相互作用、小RNA的调控机制,以及沙门菌致病机制奠定了基础。     

不同滴度鸭肠炎病毒感染对鸭脾脏的转录组变化分析

为探讨不同滴度鸭肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV)感染对鸭组织器官转录组的影响,本研究采用2个不同DELD50滴度的DEV,接种50日龄健康鸭90h后,采集脾脏样本,高通量测序技术进行转录组测序,筛选差异表达基因,并应用GO与KEGG数据库进行分析。结果显示,当接种量为100×DELD5 0时,鸭脾脏差异表达基因有685个,其中上调基因341个,主要参与免疫反应、核糖体结构和酶活性等生物学过程,并在核糖体、氧化磷酸化和吞噬体信号通路中显著富集;下调基因为344个,主要参与细胞分化正调控、β转化生长因子生成正调控、酶与相关受体活性、细胞结构等生物学过程,并在细胞黏附分子、内吞作用、肠道免疫网络IgA产生、ECM受体互作、缝隙连接和黏着信号通路上显著富集。当接种量为10-2×DELD50时,鸭脾脏差异表达基因有485个,其中上调基因297个,主要参与细胞功能、蛋白结合和蛋白复合物等生物学过程,并在细胞黏附分子、吞噬体、肠道免疫网络IgA产生、球系列鞘糖脂生物合成及N-糖链合成信号通路中显著富集;下调基因188个,主要参与补体激活、肌肉组织活动调节、受体复合物、酶与受体活性等生物学过程,并在基础转录因子、PPAR信号通路、α-亚麻酸代谢等代谢途径与信号通路上显著富集。这些结果表明不同滴度DEV感染对鸭脾脏转录组产生不同的影响,为深入探究DEV致病分子机制提供基础资料。     

三穗麻鸭JAK2基因克隆与序列分析研究

为了解三穗鸭JAK2基因特征,采用分段PCR方法获取三穗麻鸭JAK2基因并进行克隆与测序,应用生物信息学相关软件进行基因分子特征分析。结果:三穗麻鸭JAK2基因全长3 393 bp,可编码1 131个氨基酸;与原鸡的核苷酸序列同源性达94.5%,氨基酸同源性达97.6%;进化树分析显示,该基因与鸡属动物亲缘关系最近。     

三穗麻鸭Cofilin2基因序列分析及其组织表达研究

为探究三穗麻鸭丝切蛋白2（Cofilin2）基因特征及其在鸭组织中的表达规律,试验根据GenBank中鸡Cofilin2基因序列设计特异性引物,利用RT-PCR方法扩增获得目的基因,利用生物信息学软件分析三穗麻鸭Cofilin2基因特征,实时荧光定量PCR方法检测Cofilin2基因在三穗麻鸭不同组织中的表达情况。结果显示,三穗麻鸭Cofilin2基因编码区大小为498 bp,可编码166个氨基酸;三穗麻鸭Cofilin2基因序列与鸡、猕猴、牛、小鼠、安大略鲑、人和猪相应序列的同源性分别为94.4%、91.6%、91.6%、87.6%、77.7%、70.5%和69.5%;系统进化树显示,Cofilin2基因在不同物种进化过程中高度保守;Cofilin2基因编码蛋白的二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲组成,三级结构呈弯曲螺旋结构;实时荧光定量PCR检测显示,三穗麻鸭Cofilin2基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、胸腺、十二指肠、腿肌和法氏囊等组织器官中均有不同程度表达,其中心脏中表达量最高,法氏囊中表达量最低。本试验结果为三穗麻鸭抗病分子机理研究奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒和轮状病毒混合感染的诊治

<正>2016年11月贵州省某猪场的新生仔猪出现精神沉郁、食欲减退或废绝、急性腹泻等临床症状。发病后该养殖场使用抗生素药物进行治疗后无明显效果。根据临床病理剖检、实验室诊断等方法,确诊为猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒混合感染。本病例就猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒感染的诊治过程进行总结和分析,以期能够为类似病例的临床诊疗提供一定的理论和实践指导意义。1临床症状该猪场1月龄内的仔猪,相继出现精神沉郁,食欲减退、     

黄芪多糖对杂交鲟用嗜水气单胞菌灭活疫苗的影响

【目的】探究黄芪多糖对嗜水气单胞菌灭活疫苗在杂交鲟鱼上的应用效果,以期发掘黄芪多糖用作疫苗佐剂的应用潜力。【方法】选取健康杂交鲟鱼140尾,随机分为4组(对照组、疫苗组、黄芪多糖组和联用组)并做相应免疫处理,分别于第0、7、14、21和28天采集血液,进行抗氧化指标(超氧化物歧化酶(SOD))和免疫相关指标(溶菌酶(LYZ)、酸性磷酸酶(ACP)、免疫球蛋白M(IgM)及补体C3(C3))检测;免疫结束时进行攻毒试验,观察鲟鱼死亡情况及其免疫组织病理变化。【结果】第7、14、21和28天时,与对照组相比,联用组和疫苗组杂交鲟鱼血清SOD、LYZ、ACP活性及IgM、C3含量均显著或极显著升高(P<0.05;P<0.01),黄芪多糖组SOD、ACP活性及IgM、C3含量均显著或极显著升高(P<0.05;P<0.01),LYZ活性无显著差异(P>0.05);与疫苗组相比,黄芪多糖组血清LYZ、ACP活性均显著降低(P<0.05),SOD活性及IgM、C3含量均无显著差异(P>0.05);与黄芪多糖组或疫苗组相比,联用组血清SOD、LYZ活性及ACP...