网箱养殖大黄鱼刺激隐核虫病及其防治

为研究大黄鱼刺激隐核虫病临床防治技术,采用自主研发的复方中草药“HD-2”以及生石灰、甲醛、双氧水和硫酸铜等作为临床中试药物进行防治试验,并通过药物挂袋预防、药物口服预防及治疗、不同浓度药物药浴治疗等3种试验方法对各种药物防治刺激隐核虫的效果进行评价.结果表明:50 mg·L-1氧化钙、10 mg·L-1三氯异氰尿酸片、100 mg·L-1复方中草药“HD-2”、100 mg·L-1双氧水、200 mg·L-1甲醛、2 mg·L-硫酸铜、2mg· L-1高锰酸钾和淡水浴均可以使鱼体表面的刺激隐核虫活力下降,解体死亡,但使用高锰酸钾、硫酸铜、三氯异氰尿酸和甲醛进行药浴时存在治疗不彻底、安全浓度低、容易造成死亡等安全隐患;在网箱边缘悬挂氧化钙固体和三氯异氰尿酸片,也能使网衣上附着的刺激隐核虫包囊数量下降,大黄鱼死亡率下降,摄食量有所提高;对患病大黄鱼以口服复方中草药“HD-2”的方式进行临床治疗试验,能使部分病鱼恢复摄食,死亡率下降15％～ 30％,病鱼体表和鳃丝上的寄生虫数量分别下降45％和60％,显示出较好的治疗效果.     

刀额新对虾原代淋巴细胞培养及其感染白斑综合征病毒（WSSV）的病理特征

为深入了解对虾白斑综合征病毒(WSSV)的致病机理和体外培养的对虾细胞对WSSV的敏感性,实验以1.5×L-15培养基培养刀额新对虾原代淋巴细胞,待细胞形成单层后接种WSSV,通过倒置显微镜、荧光显微镜、透射电子显微镜观察接种病毒后细胞的病理变化。结果显示,使用1.5×L-15培养基培养对虾淋巴组织,3 h后可观察到有细胞迁出,并能迅速形成单层,36 h后细胞的迁出汇合率可达80%,且能存活20 d以上。接种WSSV 24 h后,出现病变的细胞变圆、漂浮,细胞之间的网状结构消失,最后细胞破碎、溶解;接种WSSV 48 h后Hoechst 33342染色结果显示,感染的细胞核深染,且变形、膨大;电镜下,细胞核内含大量成簇分布的杆状病毒,细胞器被挤向细胞边缘,细胞膜轮廓模糊。研究表明,纯化的病毒粒子接种体外培养的淋巴细胞,能够使其产生明显病理变化,证明了WSSV对体外培养的淋巴细胞具有感染力,并且可在淋巴细胞中增殖。     

基于vhhP2基因的SYBR Green I实时定量PCR检测哈维氏弧菌方法的建立

根据哈维氏弧菌(Vibro harveyi)溶血素基因vhhP2的保守序列设计特异性引物, 建立了SYBR Green I实时定量PCR检测哈维氏弧菌的方法。构建含vhhP2基因的重组质粒作为标准品, 进行SYBR Green I实时定量PCR, 在Tm为60℃时, 扩增产物的熔解曲线仅有一个特异峰, 扩增所得标准曲线为y= –3.331x+37.48, 相关系数为0.998, 扩增效率为1, 最低可检测到7个拷贝。实验结果表明该检测技术具有较高的特异性、敏感性和重复性, 对哈维氏弧菌病的快速诊断和流行病学调查有重要意义。

     

刺参养殖池塘一株贝莱斯芽孢杆菌的分离及其生理特性

2014年5月,在东营的刺参(Apostichopus japonicus)养殖池塘环境中对水样和底泥样品进行了细菌分离和益生菌的筛选,共获得66株可培养细菌。以刺参"腐皮综合征"主要致病菌为指示菌进行拮抗作用实验,使用选择培养基对菌株的产淀粉酶和蛋白酶能力进行测定,筛选获得一株潜在益生菌株——DY-6,并进行了生理生化实验、16S r DNA基因序列分析、菌株生长特性及其对刺参的安全性研究。结果表明,DY-6对其指示菌假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)、灿烂弧菌(Vibrio splendidus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)均有良好的抑制作用,抑菌圈直径分别达到24 mm、22 mm、27 mm和37 mm,对淀粉和蛋白培养基的水解直径分别为28 mm和20 mm。利用该菌对刺参进行高浓度胁迫实验测试其安全性,实验期间浸浴组和投喂组刺参状态良好,没有发病和死亡现象。利用细菌生理生化和16S r DNA基因序列分析表明,DY-6与贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis CP015911)的相似性为99%。因此,初步鉴定该菌株为贝莱斯芽孢杆菌。同时,将该菌株与商品化微生态制剂产品中分离的4株益生菌进行了比较,DY-6在温度20~35℃、盐度0~35范围内生长较快,优于上述4株菌,4 h进入对数生长期,10 h达到生长高峰。筛选的贝莱斯芽孢杆菌具有良好的抑菌能力,生长速度快,并且具有广温广盐的优点,不仅能够降低疾病发生率,还可更好地适应黄河口地区夏季水温偏高、盐度波动大的特点,由此具有良好的益生菌商业化开发潜力。     

三种植物精油对美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的抑菌效果及其毒力基因表达的影响

为研究百里香精油、牛至精油和肉桂精油对海水养殖重要致病菌美人鱼发光杆菌美人鱼亚种（Photobacterium damselae subsp．damselae,PDD）的抑菌作用,采用二倍稀释法分别测定3种植物精油对6株不同致病力PDD菌株的最小抑菌质量浓度（MIC）和最小杀菌质量浓度（MBC）。采用分光光度计法检测添加精油后6株PDD生长曲线的变化;以2株高致病性PDD菌株为研究对象,分析不同浓度精油对PDD毒力基因表达量及胞外产物（extracellular products,ECP）活性的影响;分析了3种精油存储不同时间后以及在金属离子影响下的药效稳定性。结果显示,这3种精油对6株PDD菌株均具有较好的抑菌及杀菌作用,MIC为32～128 μg/mL,MBC为64～192 μg/mL;3种精油对2株高致病性PDD菌株的毒力基因表达及ECP的磷脂酶活性和溶血活性均有抑制作用,其中低浓度精油对PDD主要毒力基因的抑制作用最明显。3种精油于室温下避光存储35 d,对实验菌株的杀菌率均大于99%,显示其良好的药物稳定性;水环境中不同浓度Na+、Mg2+、Ca2+、K+等对3种精油的杀菌效果无明显影响。研究表明,3种精油均适宜开发为防治水产动物细菌性疾病的新型渔药或饲料添加剂。本研究可为拓展芳香类植物精油在水产疾病防控上的应用提供借鉴与参考。     

基于Deep Forest算法的对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)预警数学模型构建

为预报池塘养殖凡纳对虾(Penaeus vannamei)急性肝胰腺坏死病(AHPND)的发生,自2020年开始,笔者对凡纳对虾养殖区开展了连续监测工作,包括与疾病发生相关的环境理化因子、微生物因子、虾体自身健康状况等18个候选预警因子指标,通过数据标准化处理后分析病原、宿主与环境之间的相关性,对候选预警因子进行筛选,基于Python语言编程结合Deep Forest、LightGBM、XGBoost算法进行数据建模和预测性能评判,仿真环境为Python2.7,以预警因子指标作为输入样本(即警兆),以对虾是否发病指标作为输出结果(即警情),根据输入样本和输出结果各自建立输入数据矩阵和目标数据矩阵,利用原始数据矩阵对输入样本进行初始化,结合函数方程进行拟合,拟合的源代码能利用已知环境、病原及对虾免疫指标数据对目标警情进行预测。最终建立了基于Deep Forest算法的虾体(肝胰腺内)细菌总数、虾体弧菌(Vibrio)占比、水体细菌总数和盐度的4维向量预警预报模型,准确率达89.00%。本研究将人工智能算法应用到对虾AHPND发生的预测预报,相关研究结果为对虾AHPND疾病预警预报建立了预警数学模型,并为对虾健康养殖和疾病防控提供了技术支撑和有力保障。     

凡纳滨对虾白便综合征发生与环境因子、机体免疫酶活性和微生物的相关性

为系统解析凡纳滨对虾白便综合征 (white feces syndrome,WFS)的发生与环境因子、微生物因子、宿主免疫力和水体微生物群落组成的关系。实验利用水体理化因子、可培养细菌、对虾机体免疫酶活性以及高通量测序等检测技术对健康与患WFS的池塘养殖凡纳滨对虾进行比较分析。结果显示,与健康组相比,患病池塘的水温、溶解氧 (DO)、pH、盐度等水质理化因子波动趋势相似,波动范围分别为26.1~29.0 °C、4.26~6.08 mg/L、8.39~8.73和40~49,患病组DO和盐度比健康组高;健康组对虾肝胰腺内可培养细菌和弧菌含量为1.19×10⁵~7.70×10⁵和8.8×10³~1.96×10⁴ CFU/g,弧菌占比为2%~16%,患病组对虾肝胰腺内可培养细菌和弧菌含量在3.80×10⁵~2.51×10⁶和2.02×10⁵~1.49×10⁶ CFU/g范围内,比健康组高15~113倍,弧菌占比在55%~70%。碱性磷酸酶 (AKP)、酸性磷酸酶 (ACP)、溶菌酶 (LZM)、超氧化物歧化酶 (SOD)和酚氧化酶 (PO)活性在健康组内为1.21~5.64、9.17~15.25、3.56~7.43、4.83~6.70及3.10~4.55 U/mg,在患病组内为2.12~5.39、19.22~26.96、19.73~26.85、3.00~4.14及7.76~9.21 U/mg。比较分析表明,WFS的发生与可培养细菌含量、弧菌占比、ACP、LZM、PO的相关性较强。高通量测序分析表明,患病组水体菌群结构的Ace和Chao指数呈一定程度下降趋势,PCoA指数偏离度较高,放线菌门、变形菌门相对丰度降低,拟杆菌门、蓝藻门相对丰度显著升高;RDA关联分析表明,盐度、溶解氧、虾体细菌、虾体弧菌、水体细菌是影响患病对虾水体菌群结构组成的重要因子。相关研究结果为解析养殖生产中对虾WFS发生机制提供数据支撑,并为WFS的临床防控奠定理论基础。     

当前养殖刺参暴发病的病因探讨和防治对策

刺参（Apostichopus japonicus）具有很高的食用、药用和经济价值,是我国传统的海珍品。近年来,山东省和辽宁省大力发展刺参养殖业,使其一跃成为中国北方沿海水产养殖的重要新兴产业之一。目前,海参养殖已经成为拉动地方经济增长和增加渔民收入主业。2004年仅山东省鲜参产量就高达5．7万t,存养量达13亿头,     

刺激隐核虫对大黄鱼致病力及中草药抑制其世代繁殖的研究

由刺激隐核虫寄生感染而引起的"白点病"成为大黄鱼养殖生产中危害最为严重的病害之一。为研究刺激隐核虫对大黄鱼的致病力及复方中草药HD-2对刺激隐核虫世代繁殖的抑制和阻断其感染的效果,本研究在测定了患病大黄鱼产生刺激隐核虫包囊数量、大小、孵化率和幼虫产率的基础上,测定了幼虫体外存活时间和感染力。同时,研究了HD-2中草药液对刺激隐核虫幼虫、滋养体和包囊的杀除效果以及口服复方中草药HD-2对患病大黄鱼的治疗效果。结果显示,自然患病大黄鱼体型规格与产生包囊总数呈正相关,包囊直径为(340.8±64.9)μm,平均孵化率为76.4%,每个包囊可产生280±42.5个幼虫;幼虫体外最长存活时间超过24 h,幼虫孵化20 h后便丧失感染力。幼虫感染大黄鱼7 d的LD_(90)为9 712个幼虫/尾,LD_(50)为4 366个幼虫/尾。HD-2中草药液可有效杀灭刺激隐核虫幼虫,分别口服含复方中草药5、10和15 g/kg饲料30 d的实验组大黄鱼在LD50攻毒剂量下其相对感染强度较对照组分别下降32.0%、44.5%和51.8%,包囊体积较对照组分别减少35.4%、36.1%和37.3%,孵化率分别下降16.3%、23.3%和27.9%;在LD90攻毒剂量下3个实验组大黄鱼的存活率分别达到40.0%、55.0%和58.3%,显著高于对照组(8.3%),且鳃丝、胸鳍上滋养体数量较对照组显著下降。口服复方中草药HD-2对自然患病大黄鱼的治疗效果表明,采集口服15 d的3组大黄鱼的包囊数量分别较对照组下降73.1%、87.7%和93.8%,鱼体死亡率分别为58.3%、36.7%和21.7%,较对照组83.3%的死亡率明显降低,且用药组大黄鱼的生理状态明显优于对照组。由此可见,口服复方中草药HD-2能有效阻断刺激隐核虫的二次感染,抑制包囊的形成和发育,降低包囊孵化率和幼虫孵化数量,从而有效抑制了虫体的世代繁殖。     

饲料中添加3种不同投入品对筏式浅海网箱刺参(Apostichopus japonicus)养殖生长的影响

以刺参的存活率、增重率、特定生长率和肠道蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶及肠道组织结构变化为评价指标,通过42 d的养殖实验,研究了在基础饲料(空白组)中添加20%生物胶为粘合剂制备粘性饲料(粘性饲料对照组),通过添加浒苔干粉(浒苔组)、微生态制剂(微生态制剂组)、中草药(中草药组) 3种投入品对浅海筏式网箱养殖刺参生理及生长的影响。结果显示,在散失率方面,粘性饲料比空白组饲料散失率降低33.42%,添加浒苔干粉、微生态制剂、中草药对饲料散失率的影响差异不显著(P>0.05);在生长方面,中草药组的增重率和特定生长率均为最高,分别达到(41.50±1.39)%和(0.82±0.02)%/d,显著高于其他4个实验组;在存活率方面,微生态制剂组和中草药组的存活率显著高于空白组和粘性饲料对照组。其中,中草药组存活率最高,达到(94.03±2.28)%;在消化酶活性方面,浒苔组、微生态制剂组和中草药组的淀粉酶活性分别在第10、20、30天达到峰值,峰值分别为(1.70±0.05)、(1.60±0.04)、(1.77±0.04) U/mg prot;粘性饲料对照组的蛋白酶活性波动最大,其活性在第10天达到峰值为(1.78±0.09) U/mg prot;空白组、粘性饲料对照组和浒苔组的纤维素酶活性均呈现先升高后降低的趋势,在实验周期内中草药组的纤维素酶活性表现为持续上升,而微生态制剂组刺参的纤维素酶活性表现出先下降后上升的趋势,最低值为(0.14±0.01) μg/g·min;肠道组织结构方面,粘性饲料对照组的肠道黏膜上皮层厚度显著增加(P<0.05),浒苔组的肌肉层厚度显著增加(P<0.05),中草药组和微生态制剂组刺参肠道组织结构完整,上皮细胞分泌旺盛。研究表明,通过添加生物胶所制作的粘性饲料可显著降低饲料散失率,添加微生态制剂和中草药可显著提高网箱养殖刺参的成活率,并显著提高刺参个体的消化酶活力和增重率,添加浒苔对刺参生长影响不显著。