罗非鱼源Ia和Ib血清型无乳链球菌可溶性蛋白差异分析

前期研究表明,罗非鱼Oreochromis niloticus Ia和Ib血清型无乳链球菌Streptococcus agalactiae疫苗之间缺乏交叉保护力,为了从蛋白分子水平探讨其免疫原性差异的原因,在提取罗非鱼Ia和Ib血清型无乳链球菌可溶性蛋白后应用二维差异凝胶电泳(two dimension-Difference Gel Electrophoresis,2D-DIGE)分析其表达差异蛋白点,应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定这些差异蛋白,并使用DAVID生物学数据库预测经鉴定后获得的蛋白功能。结果表明:在2D-DIGE电泳上,Ia和Ib两种不同血清型无乳链球菌具有167个表达差异蛋白点,对这些蛋白点进行质谱分析获得32种蛋白,这些蛋白主要与氧化还原反应、代谢与能量前体物产生、糖代谢反应等生物学过程有关,主要参与糖解和糖异生作用、丙酮酸代谢与脂肪酸生物合成等通路;对蛋白功能的预测表明,GAPGH、半胱氨酸合成酶和锰依赖性锰超氧化物歧化酶的功能与免疫和疫苗研发相关。本研究首次证实,罗非鱼Ia和Ib血清型无乳链球菌存在较多的表达差异蛋白,部分表达差异蛋白的功能与免疫和疫苗研发相关,这可能与链球菌免疫原性有直接关系,但需要进一步地研究和证实。     

中兽药制剂"三黄连散"抗炎作用的研究

为明确三黄连散(SHLP)体内和体外抗炎效果,体外试验采用CCK-8法筛选三黄连散对RAW264.7细胞安全浓度,同时建立LPS诱导RAW264.7细胞的体外炎症模型,以评价药物效果;体内试验用二甲苯诱发小鼠急性炎症模型,测定小鼠耳郭肿胀度、脏器指数及小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和COX-2含量。结果显示,三黄连散对RAW264.7细胞的安全浓度为50 μg/mL;高、中、低剂量的三黄连散能不同程度降低细胞IL-8、TNF-α、IL-β、COX-2的分泌水平(P<0.05,P<0.01);高剂量的三黄连散能极显著降低细胞上清液中NO的分泌水平(P<0.01);高、中、低剂量的三黄连散均可极显著降低模型小鼠耳郭肿胀和血清炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和COX-2分泌水平(P<0.01);不同浓度三黄连散对小鼠脏器系数无显著影响(P>0.05)。综上表明,三黄连散体内外抗炎效果显著。     

“三黄连”合剂抗炎作用研究

通过观察"三黄连"合剂体内对二甲苯致小鼠耳肿胀炎症模型和体外对脂多糖(LPS)刺激RAW264.7细胞所致炎性反应的影响,研究该复方制剂的抗炎效果。结果表明,"三黄连"合剂高剂量(30mL/kg)、中剂量(15mL/kg)组小鼠耳肿胀率与空白对照组差异极显著(P0.01);除中剂量组的胸腺指数外,各试验组小鼠肝脏、肾脏、脾脏和胸腺指数与空白对照组无显著差异(P0.05)。"三黄连"合剂对LPS刺激的RAW264.7细胞的NO、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平的升高具有显著的抑制作用(P0.05),且呈剂量依赖关系。"三黄连"合剂在体内和体外均具有良好的抗炎效果,并且在体内无明显毒副作用和免疫抑制作用。     

罗氏沼虾不同品系的养殖对比研究

对罗氏沼虾四个选育系——新引进系、原引进系、正交系和反交系进行了养殖对比研究。研究结果表明：新引进系的生产性能最优，单位养殖产量比反交系增产3．40％，比正交系增产8．35％，比原引进系增产12．16％；杂交系的杂种优势不明显。     

丁鱥鱼人工繁殖及鱼苗培育技术

【目的】探讨丁鱥鱼人工繁殖及鱼苗培育技术,满足广大水产养殖户对丁鱥鱼苗的需求,为加快丁鱥鱼在广西的推广养殖奠定基础。【方法】2004年11月和2005年3月,两次引进丁鱥1龄鱼进行培育,2005年春挑选成熟鱼进行人工繁育。【结果】亲鱼经过半年强化培育,平均体重600 g/尾以上,雌雄鱼性腺发育到第IV～V期;以促黄体生成素释放激素类似物（LRH-A2）和地欧酮（DOM）混合物催产,经11~13 h的发情效应,均出现产卵行为;经人工孵化和鱼苗培育,第1批的人工孵化率最高,为85.0%,但由于采用池塘孵化,仔鱼遭受池塘敌害生物残食,培育失败;第2、3批的人工孵化率分别为59.3%和63.0%,采用小水泥池孵化,两批共孵化出仔鱼约93.9万尾,培育获得规格为3.0～5.0 cm鱼苗64.8万尾。【结论】通过科学合理的亲鱼强化培育、药物催产、人工孵化及鱼苗培育,可以成功繁育获得丁鱥鱼苗,但繁育过程中要注意水温调控,当水温上升到20℃以上、最好稳定在23～27℃时,应及时安排生产,以利于提高丁鱥鱼苗数量和质量。     

丁鱥鱼胚胎及仔鱼发育的观察

【目的】研究丁鱥鱼在南方较高水温条件下的生长发育情况,解决丁鱥鱼在南方推广养殖中苗种欠缺的瓶颈问题。【方法】对丁鱥亲鱼进行人工繁殖,然后对其胚胎及仔鱼发育过程进行观察记录。【结果】丁鱥鱼催产效应时间11 h,受精率为75.3%,孵化率为82.7%,仔鱼成活率59.3%,育成规格为1.5~2.0 cm鱼苗20.0万尾。丁鱥鱼受精卵呈卵圆形,大部分呈青灰色,直径0.50~0.77 mm,具粘性;在27.0~31.0℃的温度下,受精卵历时1936 min发育后孵出,有效积温为908.89℃·h;胚胎发育可划分为6个阶段30个发育时期。刚孵出仔鱼全长3.84~3.87 mm,出膜后第3 d卵黄囊吸收60%~80%,约有30%仔鱼开口摄食;第4 d卵黄囊吸收90%,约有90%仔鱼开口;出膜第5 d卵黄囊基本吸收完,但出现少许死鱼苗。【结论】丁鱥鱼适宜在南方进行繁殖及鱼苗培育,水温应稳定在20.0~27.0℃,不宜超过30.0℃,在孵化及鱼苗培育过程中注意清除敌害生物及保持清新水质,并根据水温情况及时投喂开口饵料,提高仔鱼成活率。     

罗非鱼海豚链球菌PCR检测方法的建立

为建立准确快速的海豚链球菌鉴定方法,设计合成了海豚链球菌种特异性引物CM1/CM2,进行了其特异基因片段的PCR扩增、反应条件的优化及方法的特异性和敏感性试验;同时还进行了不同检测材料的比较及9份临床样品检测.结果表明,引物CM1/CM2只能从海豚链球菌中扩增到特异性基因片段,供试的其它9种水产常见病原菌PCR扩增均呈阴性;能够检测的最低细菌数在20～30个细菌;方法可直接从病鱼的脑、肝脏、肾脏及脾脏组织检测到该菌;另外,临床菌株检测结果与基于菌株16S rRNA基因序列系统进化分析结果一致.该方法弥补了传统细菌鉴定很难将该菌鉴定到种的缺点,并显著缩短了检测时间及降低了检测成本,具有较好的应用前景.     

鲢鱼嗜水气单胞菌PCR检测方法的建立

根据基因库中嗜水气单胞菌16SrRNA基因序列,设计并合成一对特异性引物,用PCR方法对从病死鲢鱼体内分离到的1株嗜水气单胞菌进行扩增,并对PCR反应条件进行优化,同时测试了该方法的特异性和敏感性.特异性试验结果显示,该引物能扩增出680bp的嗜水气单胞菌特异基因片段,与鳗弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、温和气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、[HT5",7"]鱼[KG-*3]回[HT5"]爱德华氏菌及海豚链球菌无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法最低检测量为10pg嗜水气单胞菌基因总DNA.表明该实验所建立的PCR检测方法可用于鲢鱼嗜水气单胞菌的快速诊断,对有效治疗和控制鱼类嗜水气单胞菌病的流行具有重要意义.     

罗非鱼HSP70(tHSP70)蛋白的生物信息学分析、真核表达及质谱鉴定

运用生物信息学技术分析罗非鱼热休克蛋白70(tilapia heat shock protein,tHSP70)的理化特性、糖基化位点、跨膜区域、蛋白的细胞定位及信号肽与虹鳟等其他动物HSP70的相似性,以人工合成cDNA为模板,通过聚合酶链式反应扩增其完整CDS,并将此DNA片段与真核表达载体pGAPZa-A连接,构建pGAPZa-HSP70表达质粒,在毕赤酵母GS115中表达tHSP70蛋白,对表达上清液进行SDS-PAGE及Western-blotting分析后,采用Ni²⁺IDA层析脱盐纯化目的蛋白,并对所表达的蛋白进行糖基化PAS染色鉴定。对表达的蛋白进行SDS-PAGE后,将所获得的非预定大小(约100 ku)条带进行电离飞行时间质谱鉴定,并确定其蛋白种类。结果表明:tHSP70所含氨基酸数量为640,分子量为70 274.5 u,等电点为5.49。在哺乳动物网织红细胞(体外)的半衰期为30 h,在酵母内半衰期大于20 h,而在大肠杆菌内的半衰期也大于10 h,不稳定指数为36.64,脂肪族指数为85.58。可能分别含有6个N-和O-糖基化位点,所克隆tHSP70基因与目的基因完整编码区序列完全一致,所构建的pGAPZa-HSP70质粒能在GS115中成功表达,诱导表达上清液经SDS-PAGE及Western-blotting分析后发现,除70 ku目的蛋白外,还出现一条100 ku条带。经糖基化PAS染色证明,此100 ku蛋白可能是HSP70糖基化的结果,且能被人的兔抗HSP70抗体识别,质谱鉴定证明该条带即是tHSP70蛋白。本研究所表达tHSP70蛋白为后续罗非鱼细胞学及抗原提呈等免疫学研究奠定了基础。     

罗非鱼致病性海豚链球菌药敏及中草药提取液体外抑菌试验

采用琼脂扩散法和二倍稀释法测定了28种抗生素和10味中草药对一株罗非鱼致病性海豚链球菌(Streptococcus iniae)的抑菌作用。结果表明:28种抗菌类药物中,病原菌对头孢克洛、克拉霉素、头孢噻吩、先锋必、菌必治、头孢拉定、新生霉素、先锋Ⅴ、罗红霉素、头孢呋肟、头孢氨苄11种药物敏感,对卡那霉素、氨曲南、头孢克肟、林可霉素4种药物表现耐药性。10种中草药水提取物对海豚链球菌均有不同程度的抑菌作用,其中黄连水提物的抑菌作用最佳,其对海豚链球菌的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)分别为3.75mg/mL和7.50mg/mL,抑菌圈平均直径达20mm以上;金银花、黄芩、大黄、连翘、黄柏有一定的抑菌作用,MIC为7.50~15.0mg/mL,抑菌圈平均直径均在10mm以上;而大青叶、穿心莲、蒲公英、龙胆草的抑菌作用不明显或无抑菌效果。