倒刺(鱼巴)对五种药物的急性毒性试验

对倒剌鱼巴进行药物敏感性试验,结果表明,在室内常温(24~29℃)、静水条件下,倒刺鱼巴对5种药物的急性毒性大小依次为:孔雀石绿>硫酸铜>高锰酸钾>二溴海因>敌百虫,安全浓度分别为0.05、0.41、0.43、3.76、5.00m g/L。孔雀石绿对倒刺鱼巴的毒性最大且安全浓度较低;敌百虫和二溴海因毒性最弱,可以考虑作为倒刺鱼巴疾病防治的适用药物。     

罗氏沼虾不同品系的养殖对比研究

对罗氏沼虾(Macrobraciumrosenbergii)四个选育系——新引进系、原引进系、正交系和反交系,进行了养殖对比研究。研究结果表明:新引进系的生产性能最优,试验池单位养殖产量比反交系增产3·40%,比正交系增产8·35%,比原引进系增产12·16%;试验塘单位养殖产量比反交系增产21·24%,比正交系增产27·60%,比原引进系增产11·12%;杂交系的杂种优势不明显。     

海豚链球菌LAMP方法的建立及初步应用

为快速准确地检测鱼类海豚链球菌(Streptococcus iniae),减少由其造成的经济损失,建立了一种基于Sim基因高效、敏感的海豚链球菌环介导等温扩增(LAMP)检测技术,并对739个样品进行了检测。结果表明,该方法可以特异性地检测海豚链球菌,而不能检测无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、副乳房链球菌(Streptococcus parauberis)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)等8种参考菌株。对海豚链球菌DNA最低检测限为5.32拷贝/μL;对739个样品的检测结果显示,8种鱼类海豚链球菌的平均检出率为17.67%,池塘水和海水的检出率分别为13.33%、16.67%;该菌主要发现于罗非鱼脑组织中,其平均检出率为27.04%(43/159),而其他鱼类则主要发现于皮肤,平均检出率为24.14%(42/174);阳性样品主要来自于2014年6月至9月期间,占总检出率的65.00%。     

斑点叉尾细暴发性海豚链球菌病的研究

于2006-2007连续两年在广西横县、邕江及合浦等网箱养殖的斑点叉尾鲴Ictalurus punctatus中暴发一种流行性传染病,该病波及面广、传染性强,死亡率为30％～100％。鱼的主要发病症状为：浮头、转圈、狂游,发病后期鱼的单边眼睛浑浊、突出,且全身大面积弥漫性出血。作者先后从症状较为典型的斑点叉尾鱼心的脑、肝脏、脾脏和。肾脏组织等部位取样,分离到7株代表性菌株（CMS003～CMS005、CMS009～CMS012）。人工感染试验结果表明,分离菌株对健康斑点叉尾鲴具有很强的致病力,发病症状与自然发病斑点叉尾鲴的症状相同。采用常规形态、生理生化及海豚链球菌Streptococcus iniae特异性PCR诊断和16S rRNA基因序列系统发育进化分析的方法,对分离菌株进行分类鉴定,结果表明,分离的7株细菌均为海豚链球菌。目前,海豚链球菌已成为广西斑点叉尾鲴网箱养殖的高致病性病原菌。     

斑点叉尾鮰肠败血症病原菌的分离与鉴定

近两年来,一种严重的传染性疾病在广西斑点叉尾鮰养殖业中流行,造成鱼苗100%死亡;成鱼损失也高达30%~80%不等。为确定该病病原,对广西南宁、合浦两地患病斑点叉尾鮰脑、肝脏、脾脏和肾脏组织进行了细菌的分离、鉴定及致病性试验。结果从中分离到两株(NN和HP)G-短杆菌,人工感染试验表明,腹腔注射感染可引起健康斑点叉尾鮰100%死亡,浸泡感染可引起30%~55%死亡,并且感染发病的症状与自然发病症状相似。两株细菌的形态特征、培养特性和生理生化反应指标均与国外报道的鮰爱德华氏菌参考菌株(JCM1680)相同;两株细菌的16S rRNA基因序列与JCM1680菌株16S rRNA基因序列同源性均为99.3%。由此证实,NN和HP两株细菌为致病性鮰爱德华氏菌,其引起的传染性疾病为斑点叉尾鮰肠败血症。     

罗非鱼海豚链球菌PCR检测方法的建立

为建立准确快速的海豚链球菌鉴定方法,设计合成了海豚链球菌种特异性引物CM1/CM2,进行了其特异基因片段的PCR扩增、反应条件的优化及方法的特异性和敏感性试验;同时还进行了不同检测材料的比较及9份临床样品检测.结果表明,引物CM1/CM2只能从海豚链球菌中扩增到特异性基因片段,供试的其它9种水产常见病原菌PCR扩增均呈阴性;能够检测的最低细菌数在20～30个细菌;方法可直接从病鱼的脑、肝脏、肾脏及脾脏组织检测到该菌;另外,临床菌株检测结果与基于菌株16S rRNA基因序列系统进化分析结果一致.该方法弥补了传统细菌鉴定很难将该菌鉴定到种的缺点,并显著缩短了检测时间及降低了检测成本,具有较好的应用前景.     

三黄连合剂对罗非鱼人工感染海豚链球菌病的预防效果

[目的]探讨三黄连合剂对由海豚链球菌感染罗非鱼发病的预防效果,为罗非鱼链球菌病的免疫防治提供参考依据.[方法]分别以含30、60、120 mL/kg三黄连合剂的饵料投喂吉富罗非鱼,连续投喂7d,给药后第8d进行人工感染海豚链球菌,感染后第7d测定脾脏指数,同时于感染后0、12、24 h和7d采集血清样本,检测超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(LSZ)、碱性磷酸酶(AKP)、血清补体C3、IgM抗体水平等免疫学指标.[结果]三黄连合剂连续给药7d对吉富罗非鱼血清免疫指标均有一定影响,可显著提高吉富罗非鱼血清SOD活性(P＜0.05,下同).人工感染海豚链球菌后第7d,3个三黄连合剂处理组的罗非鱼脾脏指数较感染不给药组明显升高;在免疫指标方面,高剂量组(120mL/kg)罗非鱼的血清SOD活性、AKP活性、LSZ活性、补体C3活性、IgM抗体水平均显著或极显著(P＜0.01)高于感染不给药组.[结论]三黄连合剂可减轻因海豚链球菌感染而造成的免疫抑制,保护机体免疫系统,提升免疫力,对罗非鱼感染海豚链球菌有良好的预防效果.     

罗非鱼HSP70(tHSP70)蛋白的生物信息学分析、真核表达及质谱鉴定

运用生物信息学技术分析罗非鱼热休克蛋白70(tilapia heat shock protein,tHSP70)的理化特性、糖基化位点、跨膜区域、蛋白的细胞定位及信号肽与虹鳟等其他动物HSP70的相似性,以人工合成cDNA为模板,通过聚合酶链式反应扩增其完整CDS,并将此DNA片段与真核表达载体pGAPZa-A连接,构建pGAPZa-HSP70表达质粒,在毕赤酵母GS115中表达tHSP70蛋白,对表达上清液进行SDS-PAGE及Western-blotting分析后,采用Ni²⁺IDA层析脱盐纯化目的蛋白,并对所表达的蛋白进行糖基化PAS染色鉴定。对表达的蛋白进行SDS-PAGE后,将所获得的非预定大小(约100 ku)条带进行电离飞行时间质谱鉴定,并确定其蛋白种类。结果表明:tHSP70所含氨基酸数量为640,分子量为70 274.5 u,等电点为5.49。在哺乳动物网织红细胞(体外)的半衰期为30 h,在酵母内半衰期大于20 h,而在大肠杆菌内的半衰期也大于10 h,不稳定指数为36.64,脂肪族指数为85.58。可能分别含有6个N-和O-糖基化位点,所克隆tHSP70基因与目的基因完整编码区序列完全一致,所构建的pGAPZa-HSP70质粒能在GS115中成功表达,诱导表达上清液经SDS-PAGE及Western-blotting分析后发现,除70 ku目的蛋白外,还出现一条100 ku条带。经糖基化PAS染色证明,此100 ku蛋白可能是HSP70糖基化的结果,且能被人的兔抗HSP70抗体识别,质谱鉴定证明该条带即是tHSP70蛋白。本研究所表达tHSP70蛋白为后续罗非鱼细胞学及抗原提呈等免疫学研究奠定了基础。     

鲢鱼嗜水气单胞菌PCR检测方法的建立

根据基因库中嗜水气单胞菌16SrRNA基因序列,设计并合成一对特异性引物,用PCR方法对从病死鲢鱼体内分离到的1株嗜水气单胞菌进行扩增,并对PCR反应条件进行优化,同时测试了该方法的特异性和敏感性.特异性试验结果显示,该引物能扩增出680bp的嗜水气单胞菌特异基因片段,与鳗弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、温和气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、[HT5",7"]鱼[KG-*3]回[HT5"]爱德华氏菌及海豚链球菌无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法最低检测量为10pg嗜水气单胞菌基因总DNA.表明该实验所建立的PCR检测方法可用于鲢鱼嗜水气单胞菌的快速诊断,对有效治疗和控制鱼类嗜水气单胞菌病的流行具有重要意义.     

罗非鱼海豚链球菌PCR检测方法的建立

为建立准确快速的海豚链球菌鉴定方法,设计合成了海豚链球菌种特异性引物CM1/CM2,进行了其特异基因片段的PCR扩增、反应条件的优化及方法的特异性和敏感性试验;同时还进行了不同检测材料的比较及9份临床样品检测.结果表明,引物CM1/CM2只能从海豚链球菌中扩增到特异性基因片段,供试的其它9种水产常见病原菌PCR扩增均呈阴性;能够检测的最低细菌数在20～30个细菌;方法可直接从病鱼的脑、肝脏、肾脏及脾脏组织检测到该菌;另外,临床菌株检测结果与基于菌株16S rRNA基因序列系统进化分析结果一致.该方法弥补了传统细菌鉴定很难将该菌鉴定到种的缺点,并显著缩短了检测时间及降低了检测成本,具有较好的应用前景.