TLC-HPLC检测三黄连合剂的有效成分

[目的]以薄层色谱法-高效液相色谱法(TLC-HPLC)检测三黄连合剂的有效成分,为制定其质量标准及后期临床推广应用提供理论依据.[方法]采用TLC对三黄连合剂中的主要组分黄连、黄芩和连翘进行定性鉴别,并以HPLC对其主要有效成分黄芩苷、盐酸小檗碱和连翘苷进行含量测定.[结果]三黄连合剂TLC色谱中的图像斑点清晰,与标准品对照斑点对齐,颜色一致.HPLC测定三黄连合剂中黄芩苷、连翘苷和盐酸小檗碱分别在75.00~1200.00μg/mL(r=0.9997) 、4.17~66.67 μg/mL(r=0.9998)、9.38~150.00 μg/mL(r=0.9999)范围内线性关系良好,平均回收率分别为113.92%、100.18%和100.40%,其含量分别为5.03、0.25和0.27 mg/mL.[结论]TLC-HPLC可作为三黄连合剂的质量控制方法,且操作简便、重现性良好.     

用链球菌疫苗免疫罗非鱼前后其差异表达基因的鉴定与分析

采用抑制性差减杂交技术（SSH）成功构建了罗非鱼O reochrom is nilotica被链球菌Streptococcus iniae疫苗免疫前后正、反两个淋巴细胞cDNA差减文库,富集了免疫过程中表达谱发生变化的淋巴细胞基因,并对文库进行了斑点杂交筛选、测序和ESTs初步分析。结果表明：文库富集了高丰度的差异表达基因,阳性率较高。正向文库中筛选得到21个免疫期间表达丰度上调的基因,其中1个基因与罗非鱼已知基因具有相似性,10个基因与其他鱼类已知基因相似,1个基因与其他物种已知基因具有相似性,9个为未知新基因;负向文库中筛选得到24个免疫期间表达丰度下调的基因,其中3个与罗非鱼已知基因具有相似性,15个与其他鱼类已知基因相似,6个为未知新基因。进一步功能注解发现,正向文库功能基因包括免疫信号传导相关蛋白、防御相关蛋白、肿瘤免疫相关蛋白和淋巴细胞相关蛋白,这些基因免疫后表达丰度升高,提高了机体免疫抵抗力。负向文库功能基因包括细胞免疫相关蛋白、感染相关蛋白和肿瘤发生相关蛋白,这些基因免疫后表达丰度降低,可以降低机体感染和发病几率。     

丁鱥鱼胚胎及仔鱼发育的观察

【目的】研究丁鱥鱼在南方较高水温条件下的生长发育情况,解决丁鱥鱼在南方推广养殖中苗种欠缺的瓶颈问题。【方法】对丁鱥亲鱼进行人工繁殖,然后对其胚胎及仔鱼发育过程进行观察记录。【结果】丁鱥鱼催产效应时间11h,受精率为75.3%,孵化率为82.7%,仔鱼成活率59.3%,育成规格为1.5～2.0cm鱼苗20.0万尾。丁鱥鱼受精卵呈卵圆形,大部分呈青灰色,直径0.50～0.77mm,具粘性;在27.0～31.0℃的温度下,受精卵历时1936min发育后孵出,有效积温为908.89℃·h;胚胎发育可划分为6个阶段30个发育时期。刚孵出仔鱼全长3.84～3.87mm,出膜后第3d卵黄囊吸收60%~80%,约有30%仔鱼开口摄食;第4d卵黄囊吸收90%,约有90%仔鱼开口;出膜第5d卵黄囊基本吸收完,但出现少许死鱼苗。【结论】丁鱥鱼适宜在南方进行繁殖及鱼苗培育,水温应稳定在20.0～27.0℃,不宜超过30.0℃,在孵化及鱼苗培育过程中注意清除敌害生物及保持清新水质,并根据水温情况及时投喂开口饵料,提高仔鱼成活率。     

海豚链球菌疫苗对罗非鱼免疫功能的影响

以海豚链球菌Streptococcus iniae灭活菌苗为免疫原,通过注射、浸泡、口服3种途径对体重为(100±10)g的奥尼罗非鱼Oreochromis niloticus进行免疫,在免疫前和免疫后的第3、7、10、14、21天对试验鱼进行尾静脉采血,测定其血液中自细胞的数量、各类白细胞的数量及其吞噬活性,以及血清的抗菌活力、溶菌酶活性、超氧化物歧化酶(SOD)活力及抗体水平.在免疫后第22天对所有试验鱼按照1.0×107cfu/尾进行攻毒.结果表明:各免疫组白细胞总数、淋巴细胞、嗜中性粒细胞和单核细胞数量均显著高于对照组(P<0.05);血清的抗菌活力、溶菌酶活性和抗体水平与对照组差异显著(P<0.05),SOD活力和对照组无显著差异(P0.05);免疫的罗非鱼对海豚链球菌的抵抗力明显增强,其中注射组罗非鱼的免疫能力明显高于浸泡和口服组,加强免疫组的免疫能力均有明显增强趋势.     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位在毕赤酵母中的表达及鉴定

为了在毕赤酵母中高效表达大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)及研制具有粘膜免疫佐剂活性的无毒重组LTB,采用PCR方法从产毒型大肠杆菌H44815菌株扩增获得LTB完整编码区DNA,将其克隆到酵母表达载体pPIC9K的分泌信号肽基因下游,构建真核表达载体pPIC9K-LTB;重组质粒经核苷酸测序确认并线性化后电转化毕赤酵母菌株KM71,PCR筛选转化子,并以小量诱导表达筛选高效表达工程菌株,最后Western blotting分析甲醇诱导上清中的LTB及采用亲和层析和HiTrap Desalting预装柱脱盐纯化蛋白。结果表明,PCR克隆获得的LTB编码DNA序列与GenBank登录DNA序列完全一致,定向插入pPIC9K载体,可获得表达LTB的酵母分泌表达载体pPIC9K-LTB;电转化后的重组酵母菌KM71诱导表达产物经SDS-PAGE和Western blotting分析,发现甲醇诱导的培养基上清中含LTB,且具有较好的免疫原性。     

重组HSP70对罗非鱼外周血淋巴细胞免疫功能的影响

利用酵母重组分泌表达的罗非鱼HSP70与海豚链球菌抗原在体外非共价结合形成HSP70 -抗原复合物,通过体外增殖试验及免疫相关基因表达检测研究HSP70对罗非鱼外周血淋巴细胞免疫功能的影响.结果表明,tHsp70在体外能够与海豚链球菌菌体、胞外分泌物(ECP)结合形成HSP70-抗原复合物.tHsp70(10 μg/m...     

4种微生物DNA对罗非鱼抗海豚链球菌感染的初步研究

将4种微生物基因组DNA腹腔注射罗非鱼(Oreochromis niloticus),48 h后腹腔注射海豚链球菌,在攻毒后24和48 h采血,通过测定血清溶菌酶(LSZ)、超氧化物歧化酶(SOD)和碱性磷酸酶(AKP)活性的变化,以及血液中病原菌感染量和死亡率,探讨注射4种微生物DNA对罗非鱼抗海豚链球菌感染的作用.结果显示,注射大肠杆菌DNA的实验组,LSZ、AKP和SOD均无明显变化(P＞0.05),表现为先略低于对照组后升至正常水平;而注射鮰爱德华氏菌DNA、毕赤酵母DNA和生理盐水的实验鱼,LSZ和AKP表现出明显变化(P＜0.05),LSZ变化趋势为先增加后降低,而AKP变化趋势则不同.注射感染后除对照组外,其他处理组均有不同程度的细菌感染,其中24h大肠杆菌组感染量显著低于生理盐水组(P＜0.05),而48 h各试验组的细菌感染量均显著低于生理盐水组(P＜0.05),尤其以大肠杆菌组和嗜水气单胞菌组最低,且其死亡率也最低,表明注射一定量的大肠杆菌基因DNA和嗜水气单胞菌基因DNA能增强罗非鱼抗海豚链球菌感染能力.     

10种中草药及4种组方对罗非鱼致病性海豚链球菌体外抑菌试验

采用琼脂扩散法(打孔法)研究了黄连等10种中草药及4种组方对尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)致病性海豚链球菌(Streptococcus iniae)的抑制作用,并通过二倍稀释法测定抑菌作用较强的中草药对海豚链球菌的抑菌和杀菌浓度.结果显示:10种中草药对海豚链球菌均有不同程度的抑制作用,其中黄...     

罗非鱼海豚链球菌16srRNA基因的序列测定和系统进化分析

为了从分子水平上对～株来源于发病罗非鱼的链球菌进行分类学鉴定，本研究利用原核生物16srRNA基因通用引物对该菌株进行了16srRNA基因的克隆及序列分析。结果扩增出长约1．5kbp目的片段，测序得到一条长度为1447bp核苷酸序列。核苷酸同源性分析表明，该序列与NCBI公布的海豚链球菌（Streptococcus iniae，s．iniae）SCCF5L菌株16srRNA基因核苷酸序列同源性最高（99．496），暂称为中国广西株（S．iniae-CGX）。同时，亲源关系较近的S．iniae、S．difficile和S，agalaciate代表菌株构建的系统发育进化树显示，该菌株与S．iniae代表菌株组成同一进化分支，与s．agalaciate代表菌株组成的另一进化分支距离较近（95．596），而与S．difficile代表菌株组成的进化分支距离较远（92．3％）。本研究证实，从发病罗非鱼脑组织分离得到的致病性链球菌为海豚链球菌。     

罗非鱼感染链球菌后hsp70基因表达研究

采用实时荧光定量RT—PCR检测吉富罗非鱼感染链球菌后脑和脾脏中热休克蛋白70（hsp70）基因表达情况,并按2^-△△CT方法、使用7500 Software v2．0．1进行分析。结果表明,罗非鱼感染链球菌48h内,hsp70mRNA在脑组织表达变化不明显,而在脾脏中表达升高,攻毒感染24h后hsp70mRNA表达量是正常脾脏组织的5．5倍多,说明hsp70在罗非鱼链球菌感染的免疫反应中具有重要作用。研究结果为进一步分析hsp70在罗非鱼感染链球菌过程中所行使的功能奠定基础。