罗非鱼湖病毒核蛋白的克隆表达、抗体制备及其组织分布

近年来罗非鱼湖病毒(TiLV)在多个国家流行,对世界罗非鱼养殖业造成严重威胁。中国是罗非鱼第一养殖大国,尽管我国大陆还没有TiLV的正式报道,鉴于吉富罗非鱼是我国重要的罗非鱼养殖品种,其对TiLV的感染特性研究具有重要意义。本实验采用TiLV对吉富罗非鱼进行人工感染,随后在肝脏组织中克隆和测定了TiLV第6片段基因。罗非鱼湖病毒第6片段基因cDNA全长1044 bp,开放读码框(ORF)为954 bp,编码317个氨基酸,预测分子量为36.38 ku;5′非编码区(NCR)为19 bp,3′非编码区(NCR)为972 bp。系统进化树分析表明该蛋白属于TiLV核蛋白(NP)。随后在大肠杆菌中表达和提纯了GST融合NP蛋白,在新西兰大白兔上制备了多克隆抗体。通过酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗体效价为1∶51200,且抗体可特异性识别感染组织中的病毒NP蛋白。对吉富罗非鱼不同组织进行苏木精—伊红(H.E)染色观察,发现肝脏组织坏死并形成合胞体,脾脏部分细胞出现空泡、坏死,含铁血黄素增多,头肾细胞坏死,鳃丝上皮细胞明显解离脱落,鳃小片黏连,脑组织细胞肿大。通过蛋白印迹法(WB)和免疫组化(IHC)对人工感染TiLV的吉富罗非鱼不同组织进行检测,结果显示,NP蛋白在肝脏、脑、体肾和头肾等组织中均有表达,以肝脏组织中表达量最高。为了解吉富罗非鱼对TiLV的免疫反应,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定免疫因子TNF-α和TGF-β在主要免疫器官脾脏和头肾组织中的表达。研究表明,在感染早期(感染后12~24 h),病毒可显著抑制TNF-α和TGF-β在脾脏和头肾中的表达,可能通过抑制宿主这些免疫因子来促进病毒自身早期的复制。本研究将为进一步解读TiLV的致病机理及其高效防控提供理论基础。     

草鱼IgM的表达及B淋巴细胞的抗菌活性

为了更加了解草鱼B淋巴细胞吞噬活性,本研究采用实时荧光定量PCR(qRTPCR)检测了IgM在胚胎发育中的表达量,并且检测了IgM在不同组织中的分布以及细菌刺激下IgM的转录情况。结果显示,IgM在卵裂期到出膜前期的表达量变化不明显,在出膜后开始显著增加;IgM在检测的组织中均有分布,在头肾中表达量最高,并且其表达量在不同细菌的刺激下均显著上调。从草鱼外周血中分离纯化得到B淋巴细胞,并通过吉姆萨染色、qRT-PCR和间接免疫荧光进行了验证。细菌吞噬实验结果显示,B淋巴细胞对嗜水气单胞菌具有一定的吞噬能力,并随孵育时间增加而逐渐增强。细菌刺激B淋巴细胞后活性氧(reactive oxygen species, ROS)和一氧化氮(nitric oxide,NO)释放量显著上升;血清调理实验结果显示,通过血清调理可以显著促进B淋巴细胞ROS的释放,然而对NO的释放水平没有显著影响。研究表明,草鱼B淋巴细胞对细菌具有一定的吞噬能力,并且可以通过呼吸爆发等非特异性免疫的方式直接参与抗菌免疫。     

草鱼核因子E2相关因子2基因克隆分析及其对呼吸爆发的调控作用

呼吸爆发过程可以产生大量的活性氧,核因子E2相关因子2(Nrf2)在此过程中起着重要作用。实验克隆和分析了草鱼的Nrf2基因,随后制备了Nrf2蛋白的多克隆抗体,研究了其和呼吸爆发的关系。草鱼Nrf2基因cDNA长度为1994 bp,开放阅读框为1782 bp,编码593个氨基酸(aa)。氨基酸序列比对发现,草鱼Nrf2基因与鲤的同源性最高,为87%;草鱼Nrf2基因含有6个进化过程中保守的Neh[Nrf2-Epoxy chloropropane(ECH)homology]区。实时定量PCR(q RT-PCR)和蛋白印迹法(Western blot)检测结果表明,Nrf2基因在检测的草鱼8个组织中均有表达。Nrf2激活剂叔丁基对苯二酚(t BHQ)处理草鱼肾细胞(CIK)后,CIK细胞总抗氧化能力显著上调,产生的活性氧下调,Nrf2及其下游的HO-1和GST基因的m RNA表达上调。Western blot和免疫荧光(IF)检测结果表明,t BHQ处理CIK后,Nrf2的蛋白表达也上调,并伴随着入细胞核现象。研究表明,保守的草鱼Nrf2基因在机体中广泛表达,能通过上调自身及其下游抗氧化基因的表达下调细胞活性氧的产生,从而参与调控呼吸爆发过程。     

维生素C对鱼类生长、繁殖、抗氧化和免疫的影响的研究进展

维生素是一种微量的有机物质，是保持机体健康的必要营养素。由于多数鱼类自身不能合成维生素或者合成量少，所以必须从饲料中获取。维生素C(VC)是大多数鱼类正常生长和生理功能所必需的微量营养素之一。缺乏VC会引起一系列生理功能障碍或代谢紊乱的症状，例如身体结构畸变（脊柱弯曲、眼睛、鳃和鳍等软骨的变形）、内出血、尾侵蚀、体色变黑和生长缓慢等。VC对鱼类的生长发育、伤口愈合、铁代谢、胶原的形成、应激反应和繁殖等方面发挥重要作用。文章综述了VC的生理特性、VC对鱼类生长、繁殖、抗氧化和免疫的影响以及缺乏VC对鱼类的影响，以期为VC在鱼类生产中的应用提供参考。     

3种壳聚糖对团头鲂体外头肾吞噬细胞呼吸爆发功能的影响

采用51%Percoll非连续密度梯度离心法分离团头鲂头肾吞噬细胞,在光镜和电镜下观察所分离细胞的显微、超微结构及吞噬作用;以二氢罗丹明(DHR123)为荧光探针,流式细胞仪检测细胞在佛波豆蔻酸乙酯(PMA)刺激下产生的呼吸爆发活动;光镜下观察壳聚糖对吞噬细胞吞噬功能的影响。结果表明:分离得到的细胞具有吞噬细胞(巨噬细胞与中性粒细胞)的形态学及功能特征;3种壳聚糖组(100μg/mL)均能提高吞噬细胞的呼吸爆发功能,在发荧光细胞比例及细胞发荧光强度上均极显著高于对照组。其中水溶性壳聚糖组的发荧光细胞比例显著高于其他试验组,而在细胞发荧光强度上,普通壳聚糖作用相对较高;同时壳寡糖能增强吞噬细胞的吞噬活性。     

淡水水产品质量与安全专题创新性实验教学的探索与实践

大学生创新性实验教学不仅是大学教学体系中的一个重要方面,也是培养创新型人才不可缺少的重要途径.该文结合创新性实验教学的实际情况,提出高等教育改革必须突破传统的教学结构,采用主导—主体教学结构进行创新性实验教学,并对具体教学方法和教学手段进行探究和实践,以期获得更好的教学效果,从而培养出具有高度创新能力的21世纪新型人才.     

基于Cytb及AFLP标记探讨仿石鲈科及相关科属分子系统进化关系

为从分子水平澄清我国仿石鲈科(Haemulidae)鱼类分类争议, 研究测定分析了仿石鲈科及其相关科属共 66 种鱼类的线粒体 DNA 细胞色素 b (Cyt b)部分序列, 结合 AFLP 标记信息, 共同探讨仿石鲈科及相关争议科属系统分类关系。结果表明, 在 Cyt b 基因上, 66 种鱼类一致序列为 729 bp, 编码 243 个氨基酸; AFLP 图谱中, 6 对引物组合共得到 669 条清晰条带, 多态性条带 669 条, 多态性比率 100%。基于 Cyt b 基因利用最大似然法与 AFLP 标记基于 UPGMA 聚类法构建的系统进化树大致相同, 进化树上, (1)仿石鲈科鱼类主要形成石鲈亚科(Haemulinae)与胡椒鲷亚科(Plectorhynchinae)两大分支, 石鲈属(Pomadasys)、仿石鲈属(Haemulon)、异孔石鲈属(Anisotremus)等 7 个属聚为石鲈亚科分支, 胡椒鲷属(Plectorhinchus)、少棘胡椒鲷属(Diagramma)与矶鲈属(Parapristipoma) 3 个属聚为胡椒鲷亚科分支。(2)髭鲷属(Hapalogenys)与眶棘鲈属(Scolopsis)没有与仿石鲈科聚在一起, 髭鲷属独自形成一支, 眶棘鲈属与金线鱼科(Nemipteridae)聚为一支。(3)鯻科(Teraponidae)的种类也没有与仿石鲈科鱼类相聚, 鯻科与舵鱼科(Kyphosidae)、石鲷科(Oplegnathidae)存在更近的亲缘关系。对于仿石鲈科及相关科属的分类争议, 研究支持仿石鲈科分为石鲈亚科与胡椒鲷亚科两个亚科, 以及鯻科、眶棘鲈属、髭鲷属不应该归为仿石鲈科的观点。     

新书介绍

由中国科学院科学出版资金资助,科学出版社出版,华南师范大学生物系张剑英教授等编的《鱼类寄生虫与寄生虫病》一书于1999年10月份出版发行．该书是我国首本获得中国科学院出版资金资助的鱼类寄生虫研究领域的巨。     

血红蛋白介导草鱼肾细胞凋亡的机制

本研究以草鱼CIK细胞为研究对象,系统研究血红蛋白对CIK细胞的损伤机制。首先,本研究观察了血红蛋白和血红素刺激CIK细胞后细胞的生长情况,观察结果显示,血红蛋白和血红素明显抑制CIK细胞的正常生长。其次,检测了血红蛋白和血红素刺激对CIK细胞内铁代谢相关基因的表达情况,结果表明,血红蛋白和血红素的刺激不同程度的上调了铁代谢相关基因的表达。然后,本研究也检测了血红蛋白和血红素刺激CIK细胞后,细胞炎症和抗氧化酶相关基因的表达情况,研究表明,血红蛋白和血红素可以通过NF-κB途径激活下游炎症因子的表达,如促炎因子TNF-α,IL-1β和IL-6,抑炎因子IL-10以及趋化因子IL-4和IL-8等,也同时激活了超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）、过氧化氢酶（Catalase,CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase,GSH-PX）三种抗氧化酶基因的表达水平。为进一步检测血红蛋白对CIK细胞的毒性作用,本研究也检测了血红蛋白刺激CIK细胞后,细胞内铁离子和ROS的变化情况,结果显示血红蛋白的刺激显著增加了细胞内铁离子和ROS的含量。最后,我们也检测了血红蛋白和血红素刺激CIK细胞后,胞凋亡相关基因的表达情况,结果显示,血红蛋白和血红素都在不同程度上显著激活了CIK细胞凋亡相关基因的表达水平。总之,本研究结果表明,高氧化活性的血红蛋白可以激活细胞内铁代谢和炎症因子相关基因的表达,同时增加细胞内铁离子和ROS水平导致CIK细胞凋亡基因的高表达。     

MiR-155靶向踝蛋白调控柱状黄杆菌胞外多糖诱导的EPC细胞凋亡

柱状黄杆菌胞外多糖 (FC-EPS) 孵育能显著提高鲤上皮瘤细胞 (EPC) 中 miR-155 的表达,导致细胞发生凋亡。为研究 miR-155 在 FC-EPS 诱导的细胞凋亡中的作用机制,本文采用 RNAi 技术,通过过表达 miR-155 和敲降踝蛋白 (talin-1),皆能抑制 FC-EPS 诱导的细胞凋亡,并鉴定出 talin-1 为 miR-155 的靶蛋白。在 FC-EPS 诱导细胞凋亡的过程中,踝蛋白水平显著升高,在凋亡发生阶段检测到凋亡执行蛋白 caspase-3 的活化,同时检测到两条踝蛋白剪切异构体,大小约为200 kDa 和 250 kDa;将构建的鲤 talin-1 真核表达质粒转染 EPC 细胞,过表达的 talin-1 延迟且延长了细胞凋亡的进程,并检测到上述两条踝蛋白异构体。然而,当以 FC-EPS 转染 EPC 细胞时,talin-1 先下降再恢复到正常水平,细胞不发生凋亡。因此,在 FC-EPS 诱导细胞凋亡的过程中,细胞通过上调 miR-155 来调控靶基因 talin-1 mRNA 和蛋白转录的变化,以及产生 talin-1 蛋白异构体来抑制细胞发生凋亡。本文为有效防治柱状黄杆菌疾病提供新思路。