广西龟鳖致病菌及其药敏特性调查

为了解引起广西养殖龟鳖细菌性疾病的病原菌种类及其药敏特性,对2015—2016年来自广西各地的63例龟鳖病例进行病原菌的分离与纯化,并采用BIOLOG自动微生物鉴定系统结合16S r DNA测序对各病原菌进行鉴定,同时采用K-B纸片扩散法测定病原菌对头孢哌酮等27种常用抗菌药的敏感性。结果显示:被检的63例龟鳖病例中,有38例分离到以嗜水气单胞菌、肺炎克雷伯菌和变形杆菌为主的病原菌48株,25例没有分离到细菌,细菌检出率为60.3%(38/63)。各致病菌表现出不同的药敏谱和耐药谱,其中对特治星的敏感率最高,达58.3%,其次是头孢曲松和米诺环素,均为52.1%,最低的是多黏菌素B,为6.3%;对四环素的耐药率最高,达85.4%,其次是多黏菌素B,为70.8%,最低的是头孢曲松,为14.6%。说明广西龟鳖疾病仍以细菌性疾病为主,且病原复杂、存在混合感染;所检出的致病菌均存在多重耐药性。     

红螯螯虾卵黄蛋白原VWD结构域的原核表达及纯化

【目的】原核表达红螯螯虾（Cherax quadricarinatus）卵黄蛋白原（Vg）VWD结构域,为深入开展Vg的生物学功能研究和开发相应的生物活性物质提供技术支持,也为改进虾类养殖催熟及获取高质量后代打下基础。【方法】在GenBank中搜索红螯螯虾卵Vg的mRNA序列（AF306784.1）及查找其VWD结构域（2345~2491 aa）,采用ExPASyProtParam、ProtScale、InterProscan及TMHMM等在线软件进行生物信息学分析及理论评估,结合大肠杆菌密码子偏好优化原始VWD氨基酸序列;然后通过全基因合成获得目的基因,连接至载体pET-28a构建重组质粒pET-28a-VWD,挑取阳性克隆转化大肠杆菌BL21（λDE3）感受态细胞及采用IPTG进行诱导表达,并以10% SDS-PAGE电泳和Western blotting检测诱导表达的融合蛋白。【结果】红螯螯虾VWD结构域相对分子量为19692.11 Da,理论等电点（pI）为9.35,分子式为C₈₅₅H₁₃₃₄N₂₅₈O₂₆₁S₉,属于不稳定的亲水性蛋白,不含跨膜结构域。延伸链和无规则卷曲是红螯螯虾VWD结构域二级结构的主要元件,其中,α-螺旋占7.73%,β-转角占10.50%,延伸链占35.91%,无规则卷曲占45.86%。重组质粒pET-28a-VWD经大肠杆菌BL21（λDE3）感受态细胞诱导表达即获得融合蛋白VWD,以2 mol/L盐酸胍溶解和Ni-NTA亲和层析纯化及复性后,10% SDS-PAGE电泳和Western blotting检测均在蛋白相对分子量约20.0 kD处出现1条清晰的特异性条带,融合蛋白VWD表达形式以包涵体为主。融合蛋白VWD在BL21（λDE3）感受态细胞中高效表达的最佳诱导条件:当单克隆菌液OD_{600 nm}达0.6时添加0.5 mmol/L IPTG,置于20℃下诱导培养16 h。纯化后的融合蛋白VWD浓度为1.32 mg/mL。【结论】通过全基因合成获得的优化红螯螯虾VWD基因能在大肠杆菌BL21（λDE3）感受态细胞中诱导表达出以包涵体为主要形式的融合蛋白,经盐酸胍溶解和Ni-NTA亲和层析柱纯化及复性即可获得高纯度的活性VWD蛋白,为后续开展红螯螯虾Vg生物学功能研究及开发相应的生物活性物质提供技术支持。     

吉富罗非鱼生长模型研究

采用Von Bertalanffy生长方程(VB GF)、逻辑斯谛生长方程(Logistic GF)、Gompertz生长方程(Gompertz GF)和灰色动态生长方程(GD GF)等4种常用动物生长模型对网箱养殖的吉富品系尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)的生长进行拟合,根据各模型拟合残差平方和的大小判断拟合程度.结果表明:VB GF生长模型对体重生长的拟合效果最好,而Gompertz GF生长模型对吉富罗非鱼体长生长的拟合效果最好.从实际拟合结果综合评价来看,VB GF生长方程最好,体长、体重生长方程分别为L,=39.008 (1-1.005e-008t),R2=0.993;Wt= 1514.50(1 - 1.025e-0.101r)3,R2=0.999,体重生长拐点为11.13月龄,相应的体长为22.92 cm,体重为448.74 g.吉富罗非鱼生长模型可以用于描述罗非鱼生长过程,反映机体生长发育规律,可为罗非鱼规模化养殖和选育工作提供参考.     

罗氏沼虾不同地理种群亲本形态及繁育性能比较

选择表型性状优良的罗氏沼虾3个不同地理种群(孟加拉、越南、缅甸种群)的亲本作为研究对象,分析其形态差异及繁育性能,以期为该虾的优选优育和远缘杂交研究提供依据。试验结果:孟加拉、越南种群亲本的体长、体质量、卵质量之间无显著差异,但都显著高于缅甸种群;孟加拉种群雄虾的头胸甲占整个身体的比例显著高于其他两个种群(P0.05),其雄虾的繁殖性状优于越南种群;越南种群抱卵虾的腹部较孟加拉种群的长而宽,表明越南种群的雌虾具有较优的抱卵空间优势,缅甸种群抱卵虾的腹部表现退化,趋于小型化;孟加拉种群、越南种群的单位面积育苗量分别较缅甸种群高11.7%、7.1%;越南种群子一代的体质量绝对增长量、特定生长率分别比缅甸种群高4.1%、5.2%,40、50 d体质量变异系数比缅甸种群高5.0%、24.7%。结果表明,孟加拉种群、越南种群表现出遗传多样性丰富、遗传性状好、生长速度快等特点,而缅甸种群表现出生长慢、性早熟、经济性状较差等特点,选用越南种群的雌虾与孟加拉种群的雄虾进行种内杂交选育,其子一代可以实现生产性能优势互补。     

不同糖源对罗氏沼虾生长性能和糖代谢的影响

本试验旨在研究不同糖源对罗氏沼虾生长性能与糖代谢的影响。试验分别以糊精、小麦淀粉、玉米淀粉、α-淀粉、蔗糖、葡萄糖为糖源,配制成6种等氮等能的半纯化饲料,饲喂6组罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)[初始体长(2.05±0.38) cm、初始体重(3.74±0.83) g]12周,每种饲料投喂3个养殖桶(重复),每个养殖桶放养40尾虾。结果显示:1)饲料糖源对肥满度(CF)无显著影响(P0.05),肝胰指数(HSI)和内脏指数(VSI)以葡萄糖组最高,小麦淀粉组最低。玉米淀粉组增重率(WGR)、特定生长率(SGR)和饲料效率(FE)最高,蔗糖组、葡萄糖组的FE和蛋白质效率(PER)显著低于糊精组、小麦淀粉组、玉米淀粉组、α-淀粉组(P0.05)。2)小麦淀粉组的全虾、肌肉、肝胰腺粗蛋白质含量最高,葡萄糖组的全虾和肌肉粗蛋白质含量最低,且均显著低于其他各组(P0.05)。糊精组、蔗糖组、葡萄糖组全虾和肌肉的粗脂肪含量显著高于其他3组(P0.05)。α-淀粉组的肝糖原含量最高,是蔗糖组、小麦淀粉组的4倍左右(P0.05),α-淀粉组、葡萄糖组的肌糖原含量显著高于其他各组(P0.05)。血清甘油三酯(TG)和总胆固醇(T-CHO)含量与血清葡萄糖和肌糖原含量呈正相关。3)肝胰脏己糖激酶(HK)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)活性不受饲料糖源的显著影响(P0.05),丙酮酸激酶(PK)、磷酸烯醇式丙酮酸激酶(PEPCK)活性则受饲料糖源的显著影响(P0.05)。综合上述试验结果得出,6种糖源中,小麦淀粉、玉米淀粉这2种多糖对罗氏沼虾生长的促进效果更好,可为罗氏沼虾饲料的糖源。     

全雌吉富罗非鱼家系选育及其生长性能分析

[目的]建立XX型全雌吉富罗非鱼家系,为今后进行全雄吉富罗非鱼规模化制种提供优质母本,进而为罗非鱼性别控制及育种研究提供基础材料.[方法]通过给仔鱼连续15 d投喂60 mg/kg的甲基睾丸酮(MT)诱导获得表型全雄吉富罗非鱼,经测交筛选获得伪雄吉富罗非鱼(:XX),与常规雌性吉富罗非鱼(:XX)交配繁育全雌罗非鱼家系,经过3个世代选育获得全雌和伪雄吉富罗非鱼.根据吉富罗非鱼生殖孔外观结构差异进行性别鉴定;测量150日龄时各吉富罗非鱼家系的体长和体重,并计算罗非鱼肥满度.[结果]MT诱导吉富罗非鱼的雄性率达100.0%;吉富罗非鱼选育家系F1~F3代的平均雌性率分别为80.3%、92.4%和99.9%,分别获得5、5和6个全雌家系,其中F3代仅有1个非全雌家系(雌性率为99.4%).吉富罗非鱼选育家系F1~F3代150日龄雄性罗非鱼的平均体重分别为815.4、857.9和930.1 g,较对照组提高8.73%、14.62%和21.31%,其中F2和F3代的体重显著高于对照组(P<0.05,下同);3个世代雄性罗非鱼平均体长分别为25.63、25.48和26.22 cm,较对照组提高3.51%、2.87%和4.42%,F3代的体长显著高于对照组.吉富罗非鱼选育家系F1~F3代150日龄雌性罗非鱼的平均体重分别为733.9、745.0和789.8 g,较对照组显著提高12.13%、16.48%和24.99%;平均体长分别为24.57、24.35和24.79 cm,较对照组提高3.93%、3.13%和4.07%,其中F1代的体长显著高于对照组.经过3个世代选育,吉富罗非鱼的生长性能得到大幅提升,F3代吉富罗非鱼选育家系的平均体重提高22.97%,保种家系的平均体重提高28.62%,且肥满度也得到明显提高.[结论]通过MT诱导处理可批量生产伪雄吉富罗非鱼,实现全雌吉富罗非鱼的规模化制种,经过3个世代选育,获得的伪雄和全雌吉富罗非鱼生长性能显著提高,更适于吉富罗非鱼育种及性别相关研究.     

基于图像处理的鱼卵计数方法研究

针对传统的鱼卵计数方法效率低、精度差、对鱼卵有损伤等缺点,提出了基于图像处理的鱼卵计数方法：通过Matlab软件中强大的图像处理功能,对经过Photoshop预处理的图像进行灰度化、去除噪音、二值化和形态学处理,采用连通图计数和面积计数法进行鱼卵的计数,精确性在95%以上。该方法减轻了操作者劳动强度,弥补了人视觉的不足之处,可以有效地提高工作效率和计数精度,并且可避免鱼卵损伤,有利于后续工作的开展,具有一定的理论和应用价值。     

红螯螯虾卵黄蛋白原N端结构域的生物信息学分析与蛋白的表达鉴定

为研究红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)卵黄蛋白原N端结构域(vitellogenin N domain, VitN)的生物学功能并获得具有免疫特异性的红螯螯虾VitN融合蛋白,试验根据红螯螯虾卵黄蛋白原的mRNA序列(GenBank登录号为AF306784.1)获得VitN mRNA序列(编码第42～585位氨基酸),通过在线分析工具对红螯螯虾VitN进行生物信息学分析,并优化合成红螯螯虾VitN基因序列,构建重组表达质粒pET-28a-VitN,将其转化至大肠杆菌BL21(λDE3)感受态细胞中,经IPTG诱导,对红螯螯虾VitN融合蛋白进行表达、纯化、包涵体复性、Western-blot鉴定和浓度测定。结果表明：编码红螯螯虾VitN的氨基酸共544个,均为常见氨基酸,其中丙氨酸、缬氨酸和丝氨酸含量较多(占比分别为7.72%、7.72%和7.54%),色氨酸含量最少(仅占0.92%);红螯螯虾VitN的相对分子质量为64 681,理论等电点为8.69,共含有8 540个原子,分子式为C₂₆₇₁H₄₂₆₀N_7...     

14个尼罗罗非鱼家系遗传差异的微卫星标记分析

利用12个微卫星标记分析14个尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus家系的遗传多样性,以P_0代为对照,研究P_4、P_5代家系的遗传多态性,指导尼罗罗非鱼的选育。研究结果表明:14个罗非鱼家系的平均有效等位基因数、平均杂合度、平均多态信息含量分别为3.1819、0.6276、0.5753,其遗传多样性丰富;家系N312与N314遗传距离最小(0.1214),而家系N304与N306遗传距离最大(0.3137),14个家系间的平均遗传距离为0.1973;UP_GMA进化树分析结果表明,14个尼罗罗非鱼家系聚为4个分支,第一分支为家系N303,第二分支由N301、N306和N311组成,第三分支由N302、N308和N310组成,其余家系组成第四分支;P_4代尼罗罗非鱼群体遗传多态性比P_0代小幅降低,而构建P_5代家系时参考了微卫星标记的分析结果,其遗传多态性明显高于P_0和P_4代。结果表明:参考微卫星标记计算的家系间的亲缘关系,人为控制选配提高后代稀有等位基因的频率和杂合子的比例,可以有效防止近交衰退,维持较高的种群遗传多样性和选择潜力。     

IHHNV PCR检测方法改进及广西流行株基因型分析

【目的】建立并优化传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)检测及其基因分型的套式PCR,并确定IHHNV在广西流行的基因型,为有效防控广西对虾传染性皮下及造血组织坏死病(IHHN)提供参考依据。【方法】在以PCR检测IHHNV现有标准的基础上,于389F/R和309F/R两对引物扩增片段之外的绝对保守区域设计外引物IHHNVWF/WR,优化退火温度和引物浓度后建立IHHNV检测及基因分型的套式PCR,并通过与一步法PCR对比以验证其优越性;采用建立的套式PCR对546株2010—2018年收集的IHHNV广西流行株进行基因型分析,确定IHHNV在广西流行的基因型。【结果】优化后的第一轮PCR反应体系20.0μL:2×F8 FastLong PCR MasterMix 10.0μL,上、下游引物(20μmol/L)各0.8μL,DNA模板2.0μL,无核菌酶灭菌水补足至20.0μL。扩增程序:94.0℃预变性3 min;94.0℃10 s,59.0℃15 s,72.0℃15 s,进行35个循环;72.0℃延伸5 min。套式PCR检测IHHNV的灵敏度较一步法PCR提高100倍;对100份IHHNV阳性临床样品的检测结果与一步法PCR的检测结果一致,符合率达100%。从546株IHHNV广西流行株中均能扩增获得309 bp的目的条带,全部为感染型(基因1型和基因2型)。【结论】在PCR检测IHHNV现有标准基础上建立的IHHNV检测及基因分型套式PCR,其灵敏度较一步法PCR提高100倍,尤其适用于检测IHHNV含量低的样品,可为疫病监测及进出口检疫提供更敏感的技术手段。当前广西流行的IHHNV均为感染型(基因1型和基因2型)。