斑节对虾Toll9受体基因免疫功能的研究与表达分析

Toll受体蛋白(Toll receptors)是一类重要的模式识别受体,在无脊椎动物先天性免疫系统中发挥重要作用。文章对斑节对虾(Penaeus monodon)新型Toll9受体基因(Pm Toll9)进行了研究:以人源胚胎肾细胞(HEK293T)成功构建体外细胞免疫模型,通过免疫印迹方法证实Pm Toll9重组真核蛋白可在HEK293T中成功表达。双荧光素酶报告系统检测发现在200 ng转染浓度处Pm Toll9对NF-κB报告基因的激活效果显著。q RT-PCR数据证明PmToll9成功激活HEK293T细胞Toll-like receptor(TLR)信号通路,促进通路下游髓样分化因子(My D88)、肿瘤坏死因子(TNF-α)和白介素(IL-10)的上调表达,同时酶联免疫吸附测定结果证明Pm Toll9可促进TNF-α蛋白表达水平显著上调。斑节对虾体内细菌刺激实验结果显示无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)可激活Pm Toll9在肝胰腺、肠、淋巴和鳃中的表达,哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)可显著抑制Pm Toll9在肝胰腺中的表达。提示无乳链球菌可通过Pm Toll9激活Toll信号通路,引起机体免疫防御反应,而哈维氏弧菌对此过程具有一定的抑制作用。     

斑节对虾GLUT1基因cDNA的克隆与表达分析

该研究利用RACE技术克隆获得了斑节对虾(Penaeus monodon) GLUT1 (glucose transporter type 1)的cDNA全长序列;采用实时荧光定量的方法研究了PmGLUT1在斑节对虾幼体发育过程中、各个组织中及低盐胁迫下的差异表达情况。该基因cDNA开放阅读框(ORF)全长1 476 bp,可编码491个氨基酸。检测PmGLUT1基因从受精卵至仔虾期发育过程的表达情况,结果显示,PmGLUT1在幼体发育各期的表达量有所波动,但总体呈现上升趋势。组织表达分析发现,PmGLUT1在鳃组织中的表达量最高,肝胰腺次之,在卵巢中的表达量最低。急性低盐胁迫后,PmGLUT1在肝胰腺中的表达水平显著高于对照组(P<0.05),但在鳃中的表达水平显著低于对照组(P<0.05)。研究结果表明,Pm GLUT1可能在斑节对虾幼体发育及机体应对低盐胁迫过程中具有重要作用,这为进一步研究葡萄糖转运蛋白基因在斑节对虾幼体发育调控和耐低盐胁迫应答中的分子机制提供了理论依据。     

斑节对虾耐氨氮和淡水应激性状的遗传参数估计

该研究以高氨氮和淡水胁迫致死时间为衡量指标,估计了斑节对虾(Penaeus monodon)耐氨氮和淡水应激性状的遗传参数。以斑节对虾"南海1号"和非洲品系为亲本,建立了27个全同胞家系,含5个半同胞家系。利用单性状动物模型和ASReml软件估计斑节对虾幼体阶段的耐氨氮和淡水应激性状的方差组分和遗传参数。通过最佳线性无偏预测法估计所有个体和家系耐氨氮和淡水应激性状的育种值。斑节对虾耐氨氮和耐低盐的遗传力分别为0.11±0.04和0.29±0.08,且统计检验达到显著水平。斑节对虾耐氨氮和淡水应激性状的家系表型值相关系数为0.15,表现为低度线性正相关。斑节对虾耐氨氮和淡水应激性状的家系育种值相关系数为0.57,表现为中度线性正相关。因此在进行斑节对虾耐氨氮性状选育时,耐淡水应激性状也能得到一定的改良。     

恩诺沙星对卵形鲳鲹幼鱼抗氧化酶活性的影响

采用静水法,对恩诺沙星(Enrofloxacin)处理卵形鲳鲹幼鱼肝脏、后肾中酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化酶活性研究。结果表明,恩诺沙星对肝脏和后肾ACP、CAT、POD、SOD活性有显著诱导作用(P0.05),并且与药物浓度、作用时间有关,为研究恩诺沙星对卵形鲳鲹的作用机理、疾病防治提供参考。     

非洲斑节对虾健康养殖技术

该研究通过RACE (Rapid-amplification of cDNA ends) 法克隆并获得斑节对虾 (Penaeus monodon) 甲壳动物雌性激素 (Crustacean female sex hormone, CFSH) 基因PmCFSH的开放阅读框(ORF)及3'非编码区(UTR),预测编码214 氨基酸(aa)的蛋白,其含有信号肽和1个与免疫应答相关的白介素17E (IL-17E) 结构域。qRT-PCR结果显示,PmCFSH基因在各个组织中均有表达,其中在腹神经组织中的表达量最高;从受精卵时期到仔虾期的表达量呈逐渐上升趋势,其中在仔虾期表达量最高;在卵巢发育Ⅱ—Ⅳ期,随卵巢发育成熟表达量逐渐升高;革兰氏阴性菌和阳性菌均能上调PmCFSH基因的表达量,其中鳃组织PmCFSH在哈维氏弧菌 (Vibrio harveyi) 感染后第3小时和金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 刺激后第12小时达到表达高峰;而肝胰腺PmCFSH在哈维氏弧菌感染后第3小时和金黄色葡萄球菌刺激后第48小时达到表达高峰。研究表明,PmCFSH基因不仅参与幼体发育以及性腺成熟的调控,对细菌的应激也具有免疫应答响应,体现了激素的“多功能性”现象。

     

甲壳动物内分泌学研究与展望

在斑节对虾(Penaeus monodon)体内新发现了2种高血糖激素(crustacean hyperglycemic hormone, CHH)家族基因PmCHH和PmHHLPP。基因组分析结果显示,其均具有CHH-Ⅰ型基因基本的“信号肽-CPRP-KR/ER/RR-成熟肽”结构,且与已报道的CHHs基因的基因组结构相似;聚类分析结果显示,尽管PmCHH 和PmHHLPP与多个CHHs基因序列相似性超过50% (最高达99%),但与其聚为一支的基因均不是CHH-Ⅰ型基因;生物信息学分析结果显示,PmCHH和PmHHLPP的转录起始位点“A”及其核心启动子区域分别位于开放阅读框(ORF)上游的99 bp和190 bp,同时在预测其空间结构后发现,两者的三维结构中均含有4个α螺旋构型;组织表达结果显示,2个基因均在肠中有较高的表达量,而PmCHH在鳃、PmHHLPP在眼柄中表达量也较高,但在肝胰腺和肌肉中表达量较低;幼体发育阶段表达结果显示,2个基因在无节幼体Ⅲ~Ⅳ期、溞状幼体Ⅰ期和糠虾幼体期表达量均有较大波动,与代谢强度呈弱相关关系。根据其一级结构的特征和相关表达情况,可推测PmCHH和PmHHLPP均为CHHs家族基因。     

斑节对虾谷氨酰胺合成酶基因的克隆及氨氮胁迫对其时空表达的影响

根据本实验室构建的斑节对虾(Penaeus monodon)c DNA文库得到的EST序列,利用RACE技术获得了斑节对虾谷氨酰胺合成酶基因(Pm GS)的c DNA全长序列,进行了相关生物信息学分析,在此基础上采用荧光定量的方法研究了Pm GS基因在斑节对虾不同组织、氨氮胁迫过程中差异表达情况。该序列全长1 420bp,开放阅读框(ORF)为1 086 bp,3'非编码区(UTR)为294 bp,包括含有27个碱基的poly(A)尾,5'非编码区(UTR)为40 bp。ORF可编码361个氨基酸,预测分子量为40.423 ku,理论等电点为6.19。序列含有一个谷氨酰胺结合结构域(Gln-synt_C),8个磷酸化位点,2个糖基化位点。斑节对虾和中国明对虾的GS基因的相似性最高,达99%。Pm GS-mRNA在斑节对虾各组织中都有表达,在淋巴组织中表达量最高,其次为鳃组织,在胸神经中的表达量最低。96 h高浓度氨氮胁迫后,Pm GS-mRNA在肝胰腺中的表达水平显著高于对照组,但在鳃中的表达水平显著低于对照组(P0.05)。以上结果暗示,Pm GS在氨氮代谢方面具有重要的作用,可能参与了斑节对虾机体的急性氨氮胁迫应答反应。     

小丑鱼幼鱼人工配合饲料初步研究

[目的]研制经济适用的小丑鱼幼鱼人工配合饲料。[方法]利用自制的2种配合饲料和鲜虾肉（对照组）投喂全长2cm左右的克氏双锯鱼和白条双锯鱼幼鱼进行56d的养殖试验,以评价自制配合饲料对小丑鱼生长和色彩的效果。[结果]结果表明,不同饲料（饲料A、饲料B及鲜虾肉）对2种小丑鱼幼鱼生长影响无显著差异,饲料B在饲料A的基础上添加了一定量的虾青素,使用7～10d即具有明显的增色作用,达到了鲜虾所不能达到的着色效果。饲料A和饲料B交替使用比使用鲜鱼虾具有明显的优势。[结论]人工饲料取代鲜活饵料是可行的。     

生姜对尖吻鲈生长特性及免疫酶的影响

探究饲料中不同含量的鲜生姜对尖吻鲈幼鱼生长特性及免疫酶活性的影响,为鲜生姜在尖吻鲈饲料中的添加应用提供参考。将鲜生姜称重后打碎全部加入饲料中,添加量为0%、1%、3%、5%,然后对80日龄的尖吻鲈幼鱼进行饲料投喂试验,0%组为对照组,1%、3%、5%组为试验组,试验周期为42 d。结果显示,增重率和特定生长率各试验组都高于对照组,但不显著(P>0.05);肥满度在1%、3%试验组显著下降(P<0.05);体长增长率在3%试验组显著性升高(P<0.05);所有试验组成活率均显著高于对照组(P<0.05);肝过氧化氢酶活力在1%试验组显著升高(P<0.05);肝还原型谷胱甘肽含量在5%试验组显著升高(P<0.05);肝丙二醛含量在3%、5%试验组显著下降(P<0.05);血清中的免疫酶无显著变化(P>0.05)。这些结果表明饲料中添加特定比例的生姜可以提高饲料诱食性,增加尖吻鲈进食量,有助于尖吻鲈幼鱼的体长增加,在一定程度上提高尖吻鲈的增重率和特定生长率,帮助尖吻鲈机体清除自由基,提高抗氧化能力,减少肝脏损伤。     

斑节对虾腺苷酸转移酶(PmANT)基因的cDNA克隆与表达分析

利用RACE技术获得了斑节对虾(Penaeus monodon)ANT基因(PmANT)的cDNA序列。该序列全长1 388 bp,开放阅读框(ORF)为930 bp,3’非编码区(UTR)为393 bp,5’非编码区(UTR)为65 bp。ORF可编码309个氨基酸,分子量大约为33.622 ku。与所有ANT家族成员一样,PmANT蛋白具有3个重复同源的线粒体跨膜结构域,但不含信号肽和糖基化位点。相似性、同源性及系统进化树分析显示,斑节对虾的ANT基因与凡纳滨对虾的同源性和相似性最高,并与其聚为一支。采用荧光定量的方法研究了ANT基因在雌雄个体不同组织、卵巢不同发育阶段及未成熟和成熟精巢的差异表达情况。结果表明:PmANT的mRNA在各组织中都有表达,其中,在雄性个体的肌肉中表达量最高,其次为雌性肌肉,在精巢的表达量最低,且未成熟精巢低于成熟精巢。PmANT的mRNA在卵巢的表达量高于精巢,且在Ⅲ期卵巢表达量最高,Ⅳ期最低。为今后进一步研究该基因在斑节对虾性腺发育中的作用提供基础材料。