斑节对虾GRP94基因的克隆及其在不同应激条件下的表达与分析

以斑节对虾(Penaeus monodon)为研究对象, 利用RACE 技术克隆得到了斑节对虾PmGRP94基因cDNA全长, 并对其结构进行生物信息学分析。PmGRP94全长2 990 bp, 包括75 bp的5UTR、527 bp的3UTR和2 388 bp的ORF。利用实时定量PCR技术, 对PmGRP94组织特异性及其在不同pH、盐度和3种重金属应激下转录水平变化情况及特点进行了研究。结果显示, PmGRP94基因存在组织特异性, 并在肝胰腺中的表达量最高; 不同的应激条件下其表达具有明显差异, 其中在pH、铜(Cu)和锌(Zn)的应激下PmGRP94的表达显著升高。因此预测该基因可以作为斑节对虾受pH、Cu和Zn胁迫的指示基因。     

不同生长阶段斑节对虾消化酶活性变化

通过对斑节对虾不同生长阶段蛋白酶、脂肪酶及淀粉酶活性变化的分析,探讨了斑节对虾在生长过程中对蛋白质、脂肪和碳水化合物的消化利用。结果表明,根据消化酶活性,可将斑节对虾生长分为两个阶段。第1阶段,在体长10～12.5 cm阶段之前,随着个体的增大蛋白酶和脂肪酶活性不断升高;第2阶段,在12.5 cm之后,蛋白酶和脂肪酶活性呈现出一定程度的下降。肝胰腺、胃、肠3种不同消化器官的消化酶活性在不同生长期也不一致,大致上蛋白酶活性从高到低依次为:肝胰腺>胃>肠;脂肪酶活性:肠>肝胰腺>胃;淀粉酶活性:肠>胃>肝胰腺。     

血清素在斑节对虾催熟过程中的作用

在斑节对虾 Penaeus monodon 催熟催产过程中,常用的方法是切除眼柄.此实验选用体重为149.5±25.8 g的自然海区斑节对虾,比较了注射血清素(serotonin)和切除眼柄2种处理方法对斑节对虾的催熟效果.血清素注射剂量为50 μg·g -1体重,在实验的第1、5和10天注射,共计3次.结果显示,2种方法处理后,受试亲虾性腺指数(gonad somatic index,GSI)显著高于对照组,同时注射血清素的实验组亲虾的存活率及其卵子孵化率显著高于切除眼柄的实验组.实验结果表明,血清素对斑节对虾催熟有促进作用,但发挥效应所需要的时间较长;从切除眼柄手术到第一次产卵所需时间较短,但是手术后的亲虾死亡率较高.     

斑节对虾GLUT1基因cDNA的克隆与表达分析

该研究利用RACE技术克隆获得了斑节对虾(Penaeus monodon) GLUT1 (glucose transporter type 1)的cDNA全长序列;采用实时荧光定量的方法研究了PmGLUT1在斑节对虾幼体发育过程中、各个组织中及低盐胁迫下的差异表达情况。该基因cDNA开放阅读框(ORF)全长1 476 bp,可编码491个氨基酸。检测PmGLUT1基因从受精卵至仔虾期发育过程的表达情况,结果显示,PmGLUT1在幼体发育各期的表达量有所波动,但总体呈现上升趋势。组织表达分析发现,PmGLUT1在鳃组织中的表达量最高,肝胰腺次之,在卵巢中的表达量最低。急性低盐胁迫后,PmGLUT1在肝胰腺中的表达水平显著高于对照组(P<0.05),但在鳃中的表达水平显著低于对照组(P<0.05)。研究结果表明,Pm GLUT1可能在斑节对虾幼体发育及机体应对低盐胁迫过程中具有重要作用,这为进一步研究葡萄糖转运蛋白基因在斑节对虾幼体发育调控和耐低盐胁迫应答中的分子机制提供了理论依据。     

斑节对虾耐氨氮和淡水应激性状的遗传参数估计

该研究以高氨氮和淡水胁迫致死时间为衡量指标,估计了斑节对虾(Penaeus monodon)耐氨氮和淡水应激性状的遗传参数。以斑节对虾"南海1号"和非洲品系为亲本,建立了27个全同胞家系,含5个半同胞家系。利用单性状动物模型和ASReml软件估计斑节对虾幼体阶段的耐氨氮和淡水应激性状的方差组分和遗传参数。通过最佳线性无偏预测法估计所有个体和家系耐氨氮和淡水应激性状的育种值。斑节对虾耐氨氮和耐低盐的遗传力分别为0.11±0.04和0.29±0.08,且统计检验达到显著水平。斑节对虾耐氨氮和淡水应激性状的家系表型值相关系数为0.15,表现为低度线性正相关。斑节对虾耐氨氮和淡水应激性状的家系育种值相关系数为0.57,表现为中度线性正相关。因此在进行斑节对虾耐氨氮性状选育时,耐淡水应激性状也能得到一定的改良。     

斑节对虾Toll9受体基因免疫功能的研究与表达分析

Toll受体蛋白(Toll receptors)是一类重要的模式识别受体,在无脊椎动物先天性免疫系统中发挥重要作用。文章对斑节对虾(Penaeus monodon)新型Toll9受体基因(Pm Toll9)进行了研究:以人源胚胎肾细胞(HEK293T)成功构建体外细胞免疫模型,通过免疫印迹方法证实Pm Toll9重组真核蛋白可在HEK293T中成功表达。双荧光素酶报告系统检测发现在200 ng转染浓度处Pm Toll9对NF-κB报告基因的激活效果显著。q RT-PCR数据证明PmToll9成功激活HEK293T细胞Toll-like receptor(TLR)信号通路,促进通路下游髓样分化因子(My D88)、肿瘤坏死因子(TNF-α)和白介素(IL-10)的上调表达,同时酶联免疫吸附测定结果证明Pm Toll9可促进TNF-α蛋白表达水平显著上调。斑节对虾体内细菌刺激实验结果显示无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)可激活Pm Toll9在肝胰腺、肠、淋巴和鳃中的表达,哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)可显著抑制Pm Toll9在肝胰腺中的表达。提示无乳链球菌可通过Pm Toll9激活Toll信号通路,引起机体免疫防御反应,而哈维氏弧菌对此过程具有一定的抑制作用。     

斑节对虾MKK4基因的表达分析

从斑节对虾(Penaeus monodon)卵巢组织cDNA文库中筛选并获得了斑节对虾MKK4基因的cDNA片段,然后采用荧光定量的方法研究了MKK4基因在雌雄个体不同组织、卵巢不同发育阶段及未成熟和成熟精巢的差异表达情况。结果表明,MKK4的mRNA在各组织中都有表达,其中在未成熟精巢中表达量最高,其次分别为雌、雄个体的肠。在精巢不同发育阶段,其在未成熟精巢的表达量极显著高于成熟精巢。对卵巢不同发育期的研究表明,从Ⅱ期开始,随着卵巢的发育,MKK4mRNA的表达量逐渐增加,到第Ⅵ期时表达量达到最高。而在Ⅰ期的表达量虽高于Ⅱ期和Ⅲ期、低于Ⅳ期,但其与其他3期均无显著差异。     

斑节对虾钙网蛋白基因cDNA克隆和表达分析

采用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNAends,RACE)获得了1 672 bp的斑节对虾钙网蛋白(Penaeusmonodon calreticulin,PmCRT)基因cDNA序列。该序列包含37 bp的5’非编码区(UTR)和414 bp的3’非编码区(UTR)以及1 221 bp的开放阅读框(ORF),可编码406个氨基酸。预测的分子量约为46.8ku,理论等电点为4.13。序列比对分析表明PmCRT与中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)的相似性和同源性最高,分别为100%和98.8%。实时荧光定量PCR对组织表达检测的结果可知,PmCRT的mRNA在卵巢、肝胰腺、肌肉、脑、心脏、胃、眼柄和肠均有表达,卵巢的表达量最高,肌肉次之;对卵巢发育6期变化检测可知,PmCRT的mRNA在Ⅲ期卵巢表达量最高,Ⅰ期的表达量最低。以期为进一步研究该基因在斑节对虾卵巢发育中的作用提供基础数据。研究亮点:目前对斑节对虾卵巢发育的分子调控机理还知之甚少,有大量卵巢发育相关基因还不为人所知。本文研究了钙网蛋白在斑节对虾卵巢发育各期的表达谱,为阐明斑节对虾卵巢发育分子调控机理提供基础数据。     

3种来源的野生斑节对虾携带病毒情况调查

利用PCR方法,对2008年取自3个斑节对虾主产地（中国、泰国、非洲）的野生斑节对虾亲虾进行主要病毒病筛查。在所检测的210例野生亲虾样本中,均发现携带白斑综合征病毒（WSSV）、传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）或斑节对虾杆状病毒（MBV）的阳性样本,其中泰国来源的斑节对虾亲虾WSSV携带率最高,达到89.8%,而中国来源的斑节对虾亲虾IHHNV携带率最高,为8.8%。12例样本同时检测出WSSV和IHHNV（阳性率为5.7%）。该结果揭示3种来源的斑节对虾亲虾普遍携带WSSV和IHHNV,其中WSSV仍然是感染斑节对虾的主要病原。调查结果增进了对斑节对虾主产区野生亲虾健康状况的了解,并在一定程度上揭示了WSSV感染的新规律。     

三斑海马早期发育观察

【目的】明确三斑海马早期发育阶段各主要器官形态指标的异速生长现象,丰富三斑海马发育的基础生物学数据,同时为完善我国三斑海马人工育苗技术提供参考依据。【方法】以0~28日龄三斑海马为研究对象,运用光学显微镜结合个体生态学的方法进行早期发育观察,并测量各主要器官形态性状,构建异速生长模型。【结果】三斑海马与大多数鱼类形态差异明显,游泳器官为胸鳍、背鳍和臀鳍,无腹鳍和尾鳍;尾部延长,具有较强攀附功能;体表及头部具有突出的棘;吻延长,其长度约占头长的50%。三斑海马全长与日龄的关系方程为y=0.9869x+7.9538（R2=0.9860）。在0~28日龄发育阶段,三斑海马的尾长（异速生长指数1.1472）呈正异速生长,吻长（异速生长指数0.9568）呈等速生长,头长（异速生长指数0.8801）、眼径（异速生长指数0.7629）、头高（异速生长指数0.8836）、口径（45°的异速生长指数0.6803,90°的异速生长指数0.6252）、躯干长（异速生长指数0.8787）、体高（异速生长指数0.8914）、尾柄高（异速生长指数0.9428）、背鳍长（异速生长指数0.8483）及臀鳍长（异速生长指数0.6923）均呈负异速生长;头冠长和胸鳍长出现拐点,其中,头冠长的生长拐点依次为8日龄和12日龄,胸鳍长的生长拐点依次为16日龄和24日龄。【结论】三斑海马吻长等速生长保证其摄食口径和捕食能力,尾长正异速生长提供强大的攀附能力,头冠的生长速度变化在特定阶段为其提供保护,而特定阶段的胸鳍快速发育可有效提高其捕食能力。三斑海马早期生长发育过程中存在异速生长现象,主要优先发育攀附功能器官,其次是摄食器官。