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猪圆环病毒1型和2型衣壳蛋白的表达与鉴定 总被引:1,自引:0,他引:1
根据已经发表的猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)的衣壳蛋白基因(Cap)分别设计一对引物,利用PCR方法从已知的PCV1和PCV2中各扩增到一条DNA片段.将PCR产物按预定的阅读框架插入表达性质粒载体pGEX-6p-1中的谷胱苷肽转移酶(GST)基因的下游,获得重组质粒pCAP-PCV1和pCAP-PCV2,并分别转化大肠杆菌BL21.序列测定表明,所克隆的序列大小均为579 bp,其中PCV1的cap基因与GenBank中的U49186序列一致,PCV2的cap基因与DQ104422序列一致.通过对菌体裂解物的SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,证明携带重组质粒pCAP-PCV1或pCAP-PCV2的大肠杆菌均可以表达融合蛋白形式的衣壳蛋白(分别命名为GST-CAPl和GST-CAP2,分子量约为49 ku).通过免疫小鼠制备了GST-CAP1和GST-CAP2多价血清,并通过dot-ELISA进一步证明了PCV1与PCV2的抗原交叉性.猪圆环病毒衣壳蛋白的表达,将为临床检测PCV抗体提供诊断抗原以及为研制PCV单克隆抗体提供材料. 相似文献
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根据GenBank发表的志贺毒素2型变异体(shiga-toxin 2e,Stx2e)的基因序列设计1对特异性引物,建立了一种检测STEC的PCR方法.通过对已知毒素类型参考菌株的扩增,证明所建立的PCR方法能够特异鉴定STEC.采集临床疑似仔猪水肿病未死亡病例(5例)的直肠棉拭子样品和死亡病例(15例)的十二指肠病料,接种LB内汤于37℃增菌培养4~6 h后,运用所建立的PCR方法对增菌培养物进行快速检测,结果表明有19例为STEC感染.通过与细菌分离后再鉴定的比较,证明了该诊断方法具有的速度快、检出率高的特点,尤其适合于临床活体检测. 相似文献
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根据GenBank上致仔猪水肿病大肠杆菌志贺毒素(Stx2e)A单位基因序列(M21534)以及Red重组系统试剂盒提供的FRT-PGK-gb2-neo-FRT序列设计1对引物;引物的5′端与Stx2e基因同源,3′端与FRT-PGK-gb2-neo-FRT序列同源。使用合成的引物利用PCR扩增FRT-PGK-gb2-neo-FRT序列片段。将扩增的PCR片段转化带有pRedET重组质粒的产志贺毒素大肠杆菌(STEC)S451521菌株(F18+)的感受态细胞中,通过同源重组技术替换Stx2eA单位基因的805~1 152bp区域。通过卡那霉素抗性以及PCR检测获得同源重组的STEC后,将708-FLPe质粒进一步转化重组菌,利用Flp重组酶去除了重组菌的卡那霉素抗性。另外,研究还发现Stx2e基因在STEC基因组中并非单拷贝。 相似文献
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根据已发表的F18ab菌毛E亚单位的基因序列(fedE/ab),设计1对引物,利用PCR技术从10株大肠杆菌(F107/86、YCED1、YCED2、C、D、E、12F、2134P、8199、8813)中分别扩增到1个片段,并克隆至pGEM-T载体,获得重组质粒TF107E、TYCED1E、TYCED2E、TCE、TDE、TEE、T12FE、T8813E、T8199E、T2134PE。琼脂糖凝胶电泳、序列测定及分析表明,这10个片段大小均为516bp。通过与已发表的fedE/ab序列进行比较,发现这10个菌株的fedE序列高度同源,其中F107/86、YCED2、C、D、E、8813、8199、2134P的fedE序列完全相同,只有YCED1株在第45位碱基处存在1个G—A转换、12F株在第316位碱基处存在1个G—A转换。这说明F18ab和F18ac菌毛的fedE基因相同,fedE是F18菌毛的保守性亚单位。 相似文献
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为建立快速检测临床1型鸭肝炎病毒(DHAV-1)感染的方法,根据DHAV-1的vp1基因序列设计1对引物,以DHAV-1及其他常见的感染鸭的病毒基因组为模板,建立了DHAV-1的特异性RT-PCR检测方法;以10倍梯度稀释的DHAV-1 RNA为模板,测定该方法的灵敏度;采集江苏多地的疑似DHAV-1感染病料,提取基因组进行RT-PCR扩增,产物经测序鉴定后判断所建立方法的检测率。结果显示,建立的方法可以特异性扩增DHAV-1 vp1基因保守区360 bp的序列,最低可检测1 fg基因组模板,对临床样品检测率为100%。表明,成功建立了特异性强、灵敏度高且可以用于临床快速诊断DHAV-1感染的方法。 相似文献
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猪圆环病毒2型的PCR快速检测及其临床应用 总被引:5,自引:0,他引:5
根据GenBank中发表的猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)基因组序列,设计了2段特异性核苷酸引物.通过对已知PCV2和对照病毒(PCV1、伪狂犬病毒、猪细小病毒)的PCR扩增,证明所设计的引物可用于PCV2的特异性PCR检测.采集来自江苏扬州和泰州地区的157头份临床门诊病料(每头份均为脾脏和腹股沟淋巴结双份病料)进行PCR检测,发现仅从腹股沟淋巴结检出PCV2的占21.65%,仅从脾脏检出PCV2的占7.64%,从脾脏和淋巴结均可检出PCV2的占41.40%,其中扬州市地区感染率为73.47%,泰州地区感染率为66.10%.通过对扬州某屠宰场的32份腹股沟淋巴结的检测,结果表明临床健康猪的PCV2隐性感染率也高达71.88%. 相似文献
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在已构建的产志贺毒素大肠杆菌(shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC)减毒菌株F2(O139∶F18)的基础上,进一步研究其体外对野生菌株S451521的黏附抑制作用。无菌采集断奶后1周仔猪的十二指肠,并分成若干肠段(每段2cm)试验组。将肠段分别与不同比例的减毒菌株和野生型菌株吸附后,每组取相同面积肠段并置于相同体积的LB肉汤中;充分刮取肠黏膜制成混悬液后,倍比稀释并分别涂布于LB平板上培养后细菌计数;分别挑取各组平板上的单菌落120个,通过细菌分类鉴定判定减毒菌株F2对其野生菌株的黏附抑制情况。结果表明:F2株细菌能明显抑制其野生菌对仔猪上皮细胞的黏附,抑制率在84.62%以上。该结果提示减毒菌株F2作为微生态制剂的可能性,对预防仔猪水肿病具有潜在的研究价值。 相似文献
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为了验证构建的重组腺病毒rAd-SRCR59-Fc能否在猪体内有效表达游离受体及其能否抑制PRRSV感染,将重组腺病毒注射断奶仔猪,用夹心ELISA检测SRCR59-Fc表达情况;选择PRRSV易感仔猪肌肉注射重组腺病毒rAd-SRCR59-Fc(4×109 TCID50/头),5 d后与JXA1株PRRSV人工感染猪同居饲养,定期测定体温、观察临床症状,采集血样和粪样进行PRRSV定量检测,对病死猪进行病理剖检和主要器官病毒载量测定。结果显示,重组腺病毒接种猪能表达SRCR59-Fc游离受体蛋白,并持续15 d左右;与感染对照组相比,rAd-SRCR59-Fc注射组首次高热时间和临床症状均推迟3 d,第5天~第13天临床症状评分显著低于感染组(P<0.01),至试验结束(25 d)仅有1头猪死亡;肺脏无明显肉眼病变,仅见少量坏死灶,病理切片显示肺泡壁轻微增厚;第3天~第13天病毒血症水平显著低于感染组(P<0.01),第5~第13天粪排毒量低于感染组(P<0.05),器官病毒载量均显著低于感染组(P<0.01)。研究表明CD163游离受体的重组腺病毒能有效阻断PRRSV毒株感染,可以作为PRRS预防或治疗性疫苗进一步研究。 相似文献
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