广东罗非鱼无乳链球菌分离鉴定及生物学特性分析

本研究旨在明确当前罗非鱼无乳链球菌流行状况和生物学特性,为鱼源无乳链球菌病防控提供新的数据。本研究于2019—2020年,从广东罗非鱼主养区茂名、湛江地区采集病样进行无乳链球菌的分离鉴定。用PCR方法对分离株血清型及4个主要毒力基因进行检测,通过纸片法对分离菌株进行31种抗菌药物药敏试验和多重耐药研究,利用斑马鱼模型进行了致病性试验。结果显示：从261份病样中分离到35株无乳链球菌;血清型检测表明无乳链球菌分离株的血清型均为Ia型;主要毒力基因的检测证明,cylE、sodA、gapC基因在所有鱼源分离株及人源、牛源和鱼源参考株中检出率均为100%,而scpB只在人源参考菌株中检出;药敏试验结果发现,无乳链球菌分离株对19种抗菌药敏感率为90%以上,对6种抗菌药耐药率为50%以上,分离株的耐药基因型和表型部分一致,无乳链球菌分离株均多重耐药,其中5重及以上耐药的菌株为27株,占总菌株数的77.1%;斑马鱼致病试验表明,无乳链球菌分离株可导致斑马鱼不同程度的发病死亡。本研究明确了当前罗非鱼源无乳链球菌的血清型、毒力基因、耐药特性和致病性,为广东乃至全国罗非鱼无乳链球菌病的防控提供了参考。     

鸭坦布苏病毒Capsid蛋白原核表达及多克隆抗体制备

【目的】本研究选择原核表达系统表达鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus, DTMUV)核衣壳蛋白(Capsid protein),并制备其多克隆抗体,为DTMUV分子机制研究奠定基础。【方法】根据DTMUV-201909株基因序列,运用一步克隆技术将Capsid基因克隆至表达载体pET-30a(+)中,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白;使用ISA206佐剂与纯化后的重组蛋白混合乳化后免疫BALB/c小鼠,以获得多克隆抗体。间接ELISA方法测定获得的多克隆抗体效价,并对多克隆抗体进行Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)验证。【结果】试验成功构建pET-30a-Capsid重组质粒,SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白大小约为18 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果表明,该蛋白能与抗His标签鼠单克隆抗体发生特异性反应,具有良好反应原性。间接ELISA结果显示,制备的鼠抗Capisd蛋白多克隆抗体效价可达1...     

4种方法制备外周血淋巴细胞总RNA对鹅α干扰素的影响比较

无菌采取鹅外周血并进行抗凝处理,以全血提取法、细胞分离直接提取法、细胞分离培养提取法及细胞分离诱导提取法分别提取外周血中淋巴细胞的总RNA;紫外分光光度计检测总RNA的纯度和得率;以总RNA为模板通过RT-PCR法扩增鹅α-干扰素(Go IFN-α)基因,并构建重组质粒p GEMT-α,通过比较Go IFN-α序列确定各种提取方法的可行性。结果显示,4种方法提取的RNA纯度高,均可作为模板扩增出目的基因,满足后续的分子生物学研究;其中以细胞分离直接提取法制备的RNA产量最多,此结论为外周血淋巴细胞总RNA的提取提供了一种更快捷的方法。     

广西罗非鱼无乳链球菌的分离鉴定、毒力基因及耐药性研究

本研究旨在明确中国罗非鱼主养区广西各地罗非鱼无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）分离株的血清型分布、毒力基因携带情况和耐药情况,为罗非鱼无乳链球菌病的防控奠定基础。2018-2019年从广西柳州、钦州、南宁、北海等地患无乳链球菌病罗非鱼体内分离了47株无乳链球菌,并对各分离株的血清型、毒力基因分布和耐药情况进行检测和分析。血清型检测结果表明,47株无乳链球菌血清型高度一致,均为Ⅰa血清型。对4种毒力基因检测结果表明,47株无乳链球菌临床分离株cylE、sodA、gapC毒力基因的检出率均为100%,而scpB基因仅在人源参考菌株2603V/R中检出,在所有鱼源分离株中未检出。对11类（31种）常见抗生素的药敏试验结果表明,临床分离株对磺胺异噁唑、新霉素、庆大霉素、卡那霉素的耐药率达到90%以上,对氧氟沙星、左氧氟沙星、氨苄青霉素、阿莫西林、头孢克洛、头孢曲松、头孢哌酮、头孢拉定、土霉素、强力霉素的敏感性均为100%。多重耐药检测结果表明,5重以上耐药菌株占93.62%,其中9重以上耐药菌株为19.15%,且均分离自柳州地区。结果表明,广西地区罗非鱼源无乳链球菌血清型单一,均为Ⅰa血清型,且均携带多种毒力基因,多重耐药现象严重。     

不发酵或迟发酵乳糖型禽大肠埃希菌的分离鉴定

从临床疑似大肠埃希菌感染病鸡的肝脏,分离到24株能在麦康凯平板生长但呈灰白色菌落的革兰阴性中等大小杆菌.通过IMViC试验、糖发酵试验、三糖铁斜面接种试验确定为大肠埃希菌,且其中16株为不发酵乳糖型,8株为迟发酵乳糖型.血清学试验表明,其中12株(50%)为O78抗原型,9株(37.5%)为O1抗原型,3株(12.5%)未能定型.利用PCR方法检测了该24株大肠埃希菌的F1菌毛与P菌毛基因,结果表明,其中10株(41.67%)为F1+大肠埃希菌,未发现P+分离株.药敏试验发现,所有菌株均对头孢拉定和阿米卡星敏感,部分菌株对链霉素、庆大霉素、环丙沙星、复方新诺明敏感,而对新霉素均为耐药.     

大肠埃希菌F18菌毛结构亚单位抗原特性的研究

利用已经表达的大肠埃希菌F18ab和F18ac菌毛各结构亚单位(FedA、FedE、FedF)的融合蛋白GST-FedA/ab、GST-FedA/ac、GST-FedE/ab、GST-FedF/ab、GST-FedF/ac分组肌肉注射免疫成年健康家兔,分别制备抗GST-FedA/ab、GST-FedA/ac、GST-FedE、GST-FedF/ab、GST-FedF/ac的多价血清.玻板凝集试验结果表明,抗GST-FedA/ab、GST-FedA/ac、抗GST-FedE/ab、GST-FedF/ab、GST-FedF/ac多价血清均能同时凝集F18ab+大肠埃希菌F107/86株、F18ac+大肠埃希菌8813株.通过荧光抗体染色法对抗FedA/ab、FedA/ac、FedE/ab、FedF/ab、FedF/ac的单因子血清的研究,发现F18菌毛"a"抗原因子分布于FedA、FedE、FedF亚单位上,"b/c"抗原因子分布于FedA、FedF亚单位上.     

断奶仔猪腹泻病原PCR鉴定及其药敏试验

江苏某养殖场断奶仔猪发生水样腹泻,使用庆大霉素治疗无效.通过采集其中3例腹泻病猪的肛拭子样品,接种LB肉汤培养6 h后,用PCR方法检测,结果发现仔猪腹泻由产肠毒素大肠杆菌(ETEC)引起.通过细菌分离获得60株细菌,PCR检测结果表明:其中2株为LT1+ST2型ETEC、1株为ST1型ETEC,且其菌毛型均为F18ac;药敏试验结果表明:这3株细菌均对呋喃妥因高度敏感,对多黏菌素中度敏感,对环丙沙星、新霉素低度敏感,对四环素、庆大霉素耐药,对左氟沙星、头孢唑林因不同菌株也有差异.另外,在肛拭子样品中还发现大量小袋纤毛虫,选用呋喃妥因和甲硝唑治疗,所有腹泻病猪均于5 d后康复.     

通用分子佐剂与IBDV亚单位联合的疫苗免疫效果

为评价通用载体pET-mLTA-CTLA-4表达的蛋白质与传染性法氏囊病毒(IBDV)亚单位联合疫苗的免疫效果,表达重组蛋白mLTA-CTLA-4,以家兔毒性试验确定其安全性:同时RT-PCR法扩增鸡IBDV的VP2基因,构建表达载体pET-VP2;选择10日龄非免疫健康鸡进行分组试验,包括IBDV活疫苗免疫组、不同剂量VP2+mLTA-CTLA-4免疫组及空白对照组,免疫后定期检测鸡血清抗体IgG小肠黏膜抗体IgA的ELISA效价;在加强免疫后用IBDV野生毒株攻击,连续观察2周并计算保护率.结果显示,重组蛋白mLTA-CTLA-4安全无毒性,IBDV活疫苗免疫组产生的抗体IgG、IgA水平均高于重组蛋白免疫组,重组蛋白免疫组与活疫苗免疫组对鸡的保护率均为100％.表明重组蛋白mLTA-CTLA-4可与IBDV亚单位疫苗联合应用,保护鸡只免受IBDV感染.     

"乳乃康"对健康奶牛乳腺组织的刺激性试验

选用乳区LMT检测为阴性的健康奶牛8头,观察药物乳乃康对乳腺组织的刺激作用,通过给药前后7 d连续检测乳成分的变化来评价其对健康乳腺组织的刺激性。结果表明:药物组和生理盐水对照组在给药后1~2 d内乳汁中体细胞数均明显上升,与各组试验前及给药3 d后相比差异极显著(P<0.01),但2组之间差异不显著(P>0.05)。乳腺组织对异物刺激非常敏感,药物和生理盐水对其都具有一定的刺激作用;乳乃康对乳腺组织的刺激作用和生理盐水相似,可间接表明药物的刺激作用较小;2组乳蛋白、乳脂、非脂固形物、密度、凝固点等指标在试验前后以及2组之间相比均差异不显著(P>0.05),表明药物对乳腺组织无明显损伤作用。