臭鼻克雷伯氏菌感染鸭胎及其防制的研究

在西昌市各养鸭区暴发臭鼻克雷伯氏菌性眼炎的同时，当地产蛋受精卵孵化率明显下降，通过对死胚进行剖检、细菌学检查、病毒分离培养、人工感染试验及抗菌药物治疗试验证明：臭鼻克雷伯氏菌是引起当地鸭胚胎感染死亡的主要原因，该菌广泛存在于圈舍、水塘、蛋盘、孵化器 、出雏床等与种鸭活动及孵化有关的环境和器具中，鸡鸭鹅肠道健康带菌情况也较为普遍。通过对蛋壳表面及蛋内细菌分布研究及对不同保存时间种蛋的孵化率比较。人工     

SYBR GreenI定量RT—PCR快速检测H5亚型禽流感病毒方法的建立

针对H5亚型禽流感H基因保守序列设计引物,建立基于sYBRGreenI检测模式的荧光定量RT—PCR（real—timeRT—PCR,RRT—PCR）,最低检测限为2．1×10^2拷贝质粒DNA,扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,Tm=（79．5±0．3）℃,对H5N1亚型和H5N2亚型禽流感病毒灭活抗原均有阳性扩增,对H7、H9亚型禽流感病毒、健康鸡、鸭组织及其它家禽常见病原RNA无扩增,可重复性好,批内变异系数及批间变异系数分别为2．99％和5．12％;检测速度快,从样本处理到报告结果仅需5h。     

SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR检测网状内皮增生症病毒方法的建立

根据禽网状内皮组织增生症病毒(REV)长末端重复序列LTR基因保守区域设计并合成一对引物,建立基于SYBR GreenI模式的实时荧光PCR方法(Real-timePCR)。以常规PCR产物为标准品建立标准曲线,并对方法的特异性、敏感性、可重复性以及再现性、检出率进行评价。结果表明,该方法只从REV阳性样本检出扩增信号,不与其它病原出现交叉反应;熔解温度为86.8±0.5℃,无引物二聚体;扩增产物片段大小为270bp,与预期大小相符,测序结果证实为REV靶序列;在1.01×102～1.01×109拷贝之间呈现良好的线性关系,相关系数为0.999,扩增效率为99.7%,最低可检测101拷贝/反应阳性标准品,比常规PCR敏感103倍;组内变异系数、组间变异系数分别为4.80%～5.72%、0.75%～3.87%;对16例临床疑似病例进行检测,阳性率为81.25%(13/16),随机抽取7份阳性扩增产物进行测序,证实为REV序列。本研究建立的SYBR GreenI实时荧光PCR特异性强、通量高、灵敏度高、检测速度快,为REV的快速检测、分子流行病学调查以及监测REV污染疫苗情况提供新方法。     

鸡β-actin基因实时荧光定量PCR方法的建立

根据GenBank上鸡β-actin基因的序列，在保守区域设计并合成一对引物，采用SYBR Green I染料建立了荧光定量PCR法（real-time PCR）。以常规PCR产物为标准品，建立了标准曲线，并进行了熔解曲线分析。结果表明，标准曲线Ct值检测范围为12~31,扩增效率为95.1%；熔解曲线分析结果显示产物特异的单个峰，其Tm为88±0℃，检测周期从RNA提取到荧光定量PCR结束只需4 h。本试验建立的鸡β-actin基因实时荧光定量PCR法扩增效率高、检测范围广、检测周期短，为β-actin基因作为内参基因进行鸡功能基因与病原基因表达的定量分析奠定了基础。     

高致病牲蓝耳病PCR诊断及病毒分离鉴定

某种猪场经产母猪群出现以体温升高(41-42℃),食欲减少甚至废绝,部分怀孕母猪流产.仔猪皮肤发绀和呼吸困难为特征的疾病.经RT-PCR检测及病毒分离鉴定,确诊为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株感染引起的高致病性蓝耳病.     

鸭大肠杆菌脑炎的诊断及防治报告

对成都市郊区5个商品肉鸭场的以神经症状为特征的发病鸭群进行了实验室诊断,确诊为大肠杆菌性脑炎。比对24种抗菌药物的药敏试验结果显示,该分离菌对阿米卡星高度敏感,对其它抗菌药物均存在不同程度的耐药性．而且还存在多重耐药现象。选择敏感药物有效地控制了本病在发病鸭场的流行。     

TaqMan实时荧光RT-PCR快速检测H5亚型禽流感病毒

根据GenBank中100个H5亚型禽流感病毒分离株的HA基因核苷酸保守序列设计引物和TaqMan探针,对荧光定量RT-PCR反应体系和条件进行优化,并对该方法进行评价.结果表明:该方法对H5N1亚型和H5N2亚型禽流感病毒灭活抗原均有阳性扩增,对H7、H9亚型禽流感病毒、健康鸡、鸭组织及其他家禽常见病原RNA无扩增;敏感度高,最低检测限为21个拷贝质粒DNA;可重复性好,批内变异系数及批间变异系数分别为2.01%和4.93%;检测速度快,从样本处理到报告结果仅需4 h.     

乳鸽沙门氏菌性脑炎的诊断

四川某肉种鸽场500只30日龄乳鸽发生以腹泻和神经症状为特征的传染性疾病,经PCIK检测及细菌分离鉴定,初步确诊为沙门氏菌性脑炎,分离菌株的抗原结构式为4,5：i：-;药敏试验结果显示分离菌对环丙沙星、达氟沙星、诺氟沙星、洛美沙星、氧氟沙星和恩诺沙星高度敏感。     

副猪嗜血杆菌rfaD基因的克隆及原核表达

rfaD基因编码ADP-L-甘油-D-甘露庚糖-6-异构体酶,缺失该基因会导致LOS糖链缩短和疏水性增强,从而影响细菌的致病性。为进一步探索副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)ADP-L-甘油-D-甘露庚糖-6-异构体酶的功能,本研究对Hps SC096 株rfaD基因进行克隆及原核表达。根据GenBank上登录的NC_011852序列,设计引物扩增rfaD基因,获得927 bp目的片段,将其克隆至pMD19-T载体。经送样测序鉴定正确后,连接到pET-32a(+)上进行原核表达,并用IPTG诱导,将诱导产物进行SDS-PAGE和Western blotting分析。SDS-PAGE结果显示,H.parasuis rfaD基因能在E.coli BL21(DE3)中表达,重组蛋白分子质量约为50 ku,与预期分子质量大小一致。Western blotting分析结果表明,该蛋白质能与H.parasuis血清4型阳性高免血清产生特异性结合反应,具较好的反应原性。