不同温度下凡纳滨对虾和中国明对虾对白斑综合征病毒(WSSV)耐受性比较

本研究分别对凡纳滨对虾"壬海1号"(Litopenaeus vannamei"Renhai No.1")和中国明对虾"黄海2号"(Fenneropenaeus chinensis"Huanghai No.2")在3种温度条件下(24℃、28℃和32℃),采用单尾定量口饲感染白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)的方法进行感染实验,比较2种对虾在不同温度情况下对WSSV的耐受性差异(L代表凡纳滨对虾,F代表中国明对虾)。结果显示,L-24℃和F-24℃组的平均存活时间分为(184.05±69.56)h和(101.68±38.45)h;L-28℃和F-28℃组的平均存活时间分别为(100.25±26.79)h和(73.38±22.22)h,相同温度组内均存在显著性差异(P0.05);截至第15天,L-32℃和F-32℃组的存活率分别为45.74%和23.47%。3个温度组对虾在50%的死亡率时的存活时间分别为178 h和98 h、98 h和74 h、292 h和78 h;死亡高峰时间分别为第5天和第4天、第5天和第4天、第10天和第4天。另外,分别在感染后的12 h、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、15 d共9个时间点对每组对虾进行活体取样,利用实时荧光定量RT-PCR技术对其进行病毒载量检测,从对虾体内肌肉组织病毒载量的角度探寻不同对虾抗病性能的差异。6 d时,L-24℃和F-24℃组对虾肌肉内病毒载量分别达到(2.97×10~6±7.44×10~6)和(8.08×10~6±3.22×10~6)copies/ng DNA,差异极显著(P0.01),L-28℃和F-28℃组分别达到(6.73×10~6±1.49×10~6)和(1.20×10~7±6.15×10~5)copies/ng DNA,差异极显著(P0.01);15 d,L-32℃和F-32℃组分别达到(5.18×10~4±4.32×10~4)和(3.78×10~4±8.97×10~4)copies/ng DNA,差异显著(P0.05)。研究表明,2种对虾在3种温度环境下感染WSSV后,凡纳滨对虾耐受WSSV能力要高于中国明对虾;不同温度下同种对虾肌肉体内WSSV的增殖能力从强到弱依次为28℃组、24℃组和32℃组。     

凡纳滨对虾幼虾体重性状在低温波动环境下的遗传参数分析

基于凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei) 40K SNP 芯片分型信息估计了低温波动条件下幼虾体重性状的遗传参数, 为凡纳滨对虾耐低温新品种的选育提供基础数据。利用来自 40 个家系的 4000 尾凡纳滨对虾幼虾, 通过地下井水降温的方式使养殖温度从 30 ℃骤降至 20 , 24 h ℃ 自然回温后稳定 4 d。该降温–回温–稳定过程重复 3 次, 继续养殖 15 d后进行体重和存活性状测试。与对照群体相比, 低温波动条件对凡纳滨对虾幼虾生长影响显著(P＜0.05), 而对存活性状影响不显著(P＞0.05)。根据个体的系谱信息构建 A 矩阵; 利用 40K SNP 芯片对 159 尾家系亲本及其同胞个体进行 SNP 分型, 复合 SNP 信息和系谱信息构建 H 矩阵。基于 A 和 H 矩阵, 利用个体动物模型估计体重性状的方差组分和遗传参数。低温波动条件下凡纳滨对虾幼虾基于 A 矩阵获得体重的遗传力为 0.37±0.07, 基于 H 矩阵获得体重的遗传力为 0.40±0.08, 为高遗传力水平。经交叉验证, 基于两种不同矩阵的预测准确性和偏差无明显差别。研究结果表明, 低温波动条件下凡纳滨对虾幼虾的体重性状表现出丰富的遗传变异, 多代选育可能获得较大的遗传进展。     

基于转录组分析筛选凡纳滨对虾低温胁迫下的差异表达基因

凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)是中国主要的对虾养殖品种之一,对低温的耐受性较差,低于18℃就会停止摄食。为了探究凡纳滨对虾耐低温性状相关基因,选用凡纳滨对虾低温胁迫组(18℃)和常温组(24℃)肝胰腺组织为实验材料,进行Illumina HiSeq 2500测序,对测序原始数据进行拼接、注释,以及筛选分析低温胁迫下的差异表达基因。结果显示,测序共获得50921条基因(unigene),平均长度为828 bp, N50为1589 bp,其中28.13%为已知基因。基因差异表达分析共筛选得到243个低温胁迫相关基因,其中89个上调表达, 154个下调表达。功能富集分析发现,差异表达基因多富集在生物结合和催化过程、过氧化物酶、溶酶体、精氨酸和脯氨酸的代谢以及氨基酸的生物合成途径中。进一步根据Q-值共筛选出10个差异表达最显著的基因,其中ATP结合盒B亚家族6转运蛋白基因(ATP-binding cassette sub-family B member 6, ABCB6)、C型凝集素基因(C type lectin)、谷氨酰胺合成酶基因(glutamine synthetase, GS)在低温胁迫下均呈下调表达,推测可能参与了凡纳滨对虾低温应答反应。利用Real time RT-PCR验证转录组数据,结果证明基于转录组测序筛选低温胁迫下的差异表达基因是可行的。本研究为揭示凡纳滨对虾耐低温分子调控机制提供了基础数据和理论依据。     

白斑综合症病毒（WSSV）在对虾养殖过程中传播途径的调查

为探讨人工养殖条件下池塘中对虾是如何感染暴发性流行病,作者通过对人工养殖对虾暴发白斑综合症的池塘进行生物调查和取样,经ＰＣＲ检测,获得了一些有意义的结果。发现：在暴发白斑病的池塘中,中国对虾和日本对虾以及池中的脊尾白均可检测到阳性,阳性率大小与发病的程度有关;蟹类未检测到阳性个体;鱼类和底栖的沙蚕亦未检测到阳怕;浮游动物的糠虾类未检测到阳性;桡足类检测为阳性,说明桡足类是对虾白斑病毒中宿主之一,由携带病毒的桡足类水平传播给对虾等以此为饵的甲壳类动物。     

聚β-羟基丁酸酯对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)非特异性免疫力及氨氮胁迫后免疫基因表达量的影响

以凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)为研究对象,探讨饲料中添加聚β-羟基丁酸酯(Poly-β-hydroxybutyrate, PHB)对其非特异性免疫能力的影响。采用单因子浓度梯度法,在基础饲料中分别添加1.0%、2.5%和5.0%的PHB配制成实验饲料,饲喂21 d后测定对虾免疫酶活性,选择最佳浓度组与空白对照组进行氨氮胁迫实验,测定对虾丙二醛(MDA)含量,同时利用RT-PCR技术测定氨氮胁迫48 h内对虾免疫基因表达水平,观察PHB对免疫基因表达量的影响。结果显示,总抗氧化能力(T-AOC)随PHB浓度升高呈现先上升后下降的趋势,血液、肝胰腺及鳃丝中T-AOC分别在2.5%、2.5%及1.0% PHB浓度时达到最高;PHB对肝胰腺中超氧化物歧化酶(SOD)活力无显著影响,血淋巴及鳃丝中SOD活力在最高浓度组(5.0% PHB)与对照组之间差异显著(P<0.05);过氧化物酶(POD)和溶菌酶(LZM)在鳃和肝胰腺中的活力于PHB浓度为1.0%和2.5%时达到最高,其中POD相对于对照组分别提高了7.63倍和0.68倍,LZM活力分别提高了0.88及0.18倍。氨氮胁迫实验结果显示,对虾经PHB饲喂后,体内免疫基因表达量高于对照组,且体内MDA含量低于对照组。综上结果说明,PHB能提高凡纳滨对虾非特异性免疫能力。     

微卫星三重PCR基因扫描技术在中国明对虾家系标识中的应用

在开发中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)微卫星引物的基础上,利用3对微卫星引物,克隆编号分别为H081、RS0683和RS1101,构建中国明对虾的三重PCR稳定扩增体系。在此基础上,进一步利用荧光标记引物的基因扫描技术(Genescan)对利用精荚移植技术建立的中国明对虾7个半同胞家系和16个全同胞家系进行识别研究。结果表明,该项技术可以准确地把7个半同胞家系的子代个体间、16个全同胞家系的子代个体间以及总的31个全同胞家系的子代个体间区别开,且能准确把这些家系产生的任意子代个体定位到各个家系。该技术可以满足大批量家系材料样本的分析,具有较好的应用价值。[中国水产科学,2007,14(1):59-66]     

不同饵料组合对中国对虾幼体WSSV携带量及存活率的影响

采用单胞藻（SA）、配合饵料（AF）、轮虫（BP）和卤虫幼体（BS）4种饵料,设计了SA+AF、SA+AF+BP、SA+AF+BS和SA+AF+BP+BS 4种饵料组合并用于中国对虾苗种培育,投喂SA+AF饵料的受精卵分设“碘伏”消毒及未消毒组,投喂其他饵料的受精卵均为“碘伏”消毒组。分析各期幼体成活率、P10体重及WSSV携带量,结果表明,N-Z期间,受精卵消毒与否及投喂不同饵料对中国对虾的成活率差异均不显著（P>0.05）;Z-P期间,投喂BP的成活率明显高于未投喂BP组（P<0.01）;投喂SA+AF+BS的幼体在M-P期间成活率与其他饵料组差异极显著（P<0.01）;投喂SA+AF+BP 饵料组P10幼体的平均体重小于投喂SA+AF+BP+BS组的幼体（P<0.01）;SA+AF消毒组P10仔虾WSSV携带量为10.52±3.3 copies/ng DNA,低于其他饵料组仔虾的WSSV携带量（P<0.05）。在P11-P60培育期间,分别投喂菲律宾蛤仔足肌（CF）+配饵（AF）、60Co γ辐照菲律宾蛤仔足肌(RCF)+配饵（AF）、高锰酸钾消毒菲律宾蛤仔足肌（DCF）+配饵（AF）和配饵（AF）4种饵料组合。结果表明,CF+AF组对虾体重和体长增长最大,但与AF组差异不显著,而CF+AF组和AF组与其余两组差异显著（P<0.05）;4组对虾存活率差异不显著（P>0.05）。WSSV人工感染实验结果表明,4种饵料投喂的对虾累积死亡率都在90%以上,差异均不显著(P>0.05)。     

低密度养殖模式下中国明对虾社会交互效应的遗传分析

针对低密度养殖模式下中国明对虾收获体质量和眼球磨损性状的直接遗传效应(DGE)和间接遗传效应(IGE)进行了估计。为了准确估计中国明对虾收获体质量及眼球磨损性状的遗传参数,将来自G8和G9代的178个被标记的家系(G8代88个全同胞家系,G9代90个全同胞家系),共计6 408尾中国明对虾,每个家系分成3组(每组12尾),随机放入3个不同的圆缸(半径100 cm),其中,G8代88个圆缸,G9代90个圆缸。每个圆缸包含3个不同的家系,1个家系共与其他6个家系进行组合,生长测试80 d后对体质量及眼球磨损性状进行测量和评估。结果显示,使用传统的动物模型获得收获体质量的遗传力为0.11±0.05,属低遗传力水平。似然比检验结果表明,需要将IGE效应包含在模型中(LRT=5.26)。利用包含IGE的扩展动物模型估计得到的总遗传方差由DGE方差(43%)、DGE-IGE协方差(24%)和IGE方差(33%)组成,占表型方差的24%,是传统动物模型获得的遗传力的2倍多(11%)。由DGE-IGE协方差估计出收获体质量的DGE-IGE相关系数为0.32±0.45,属中度正相关,表明由于养殖密度较低,组内个体间社会交互形式为非竞争行为。利用不包含IGE的logit模型获得眼球磨损性状的遗传力估计值为0.05±0.03,属低遗传力水平。包含IGE的总遗传方差占表型方差的比值 ($ {T}^{2} $) 为2.75,显著大于1,是不包含IGE的logit模型获得的遗传力的58倍多(0.05)。上述结果表明,社会交互行为对中国明对虾收获体质量产生了更多可利用的遗传变异。与收获体质量相比,眼球磨损性状更易受个体间社会交互行为的影响,可将眼球是否磨损作为个体间社会交互行为结果的一个性状。     

基于转录组分析对中国对虾Myostatin基因调控的肌肉生长相关基因的筛选

Myostatin (Mstn)即肌肉生长抑制素,在脊椎动物中是胚胎期肌肉形成和成体肌肉生长的主要调控因子之一,通过抑制肌细胞的扩增和分化而抑制肌肉的生长和发育。为了筛选在中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)中Mstn调控的肌肉生长相关的基因,为肌肉生长调控机理奠定基础,本研究利用RNA-Seq技术对PBS对照组和Mstn表达抑制组进行了测序分析。结果显示,Mstn表达被抑制后,共筛选到1657个差异表达基因,其中,805个显著上调,852个显著下调。参考脊椎动物Mstn调控的肌肉生长经典信号通路TGF-β/Smad和MAPK通路及差异基因功能已有报道,初步筛选出29个Mstn调控的与肌肉生长相关的基因。在涉及TGF-β/Smad和MAPK通路的16个基因中,除ActRI被检测到略微上调外,其他基因均表现出不同程度的下调;在另外13个涉及蜕皮、肌肉生长等过程的基因中,促进肌肉生长的基因显示为上调。前期的研究表明,Mstn可能同脊椎动物功能类似,在中国对虾中负向调控肌肉生长,而本研究结果提供了进一步的证据,为阐明对虾的肌肉发育调控机制提供了重要基础。     

中国对虾抗病性状遗传标记筛选及遗传多样性分析

对人工选育的29个中国对虾半同胞家系进行人工感染WSSV后,选取存活时间最长和存活时间最短各29个个体,组成抗病群体和感病群体。用400个随机引物进行RAPD分析,得到与抗病正相关的特异性遗传标记5个,与抗病负相关的特异性遗传标记两个。15个随机引物在两个群体的扩增位点进行统计,共得到82个位点,其中多态位点34个,占41.46%,两个群体的多态位点比例分别为40.24%和37.8%。Shannon′s多样性指数估算两个群体的平均遗传多态度为0.2177,SLT群体的遗传多态度为0.2190略高于SST群体0.2163;群体内的遗传变异（HPOP/HSP）0.9645,可见96.45%的遗传变异来自于群体内,3.55%的变异来源于群体间。统计各座位的基因频率计算出两个群体的遗传分化指数为0.0294,表明两个群体并没有发生明显的遗传分化。