含非洲猪瘟病毒核酸序列病毒样颗粒的研制及其在检测方法中的应用

非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起的烈性传染病,为了保证其检测结果的准确性和可靠性,需要研制试剂盒中使用的阳性标准质控品。本试验旨在研制含ASFV核酸序列的病毒样颗粒,并探究其在检测方法中的应用。首先扩增p72基因的全长片段,利用昆虫杆状病毒系统,包装出含有p72基因的ASF DNA病毒样颗粒。为了进一步验证该病毒样颗粒在应用中的可靠性,本研究将病毒样颗粒与ASF的组织毒及细胞毒同时进行DNA核酸提取,进行实时荧光定量PCR。结果表明,本研究制备的病毒样粒子能很好的取代ASFV在实时荧光定量PCR检测方法中作为阳性质控品,且能对核酸提取过程进行质控,实时荧光定量PCR检测试剂盒中,病毒样粒子的最低包装浓度为10² TCID₅₀。进一步研究发现该病毒样颗粒也适用于普通PCR及LAMP检测方法中,最低浓度分别为10³和10¹ TCID₅₀。本试验结果将为规范ASF检测方法,促进ASF检测方法的转化应用及保证检测结果的准确度和可靠性提供科学依据。     

非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测技术的研究与评价

根据非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）K205R基因序列设计合成引物及TaqMan探针,通过优化引物浓度、退火温度和Mg²⁺浓度,建立基于K205R基因的ASFV实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR,qPCR）检测方法。对在猪肝脏组织DNA中掺入重组质粒制备的模拟样品进行扩增来确定所建方法的实际检测效率,并将OIE推荐的基于p72的qPCR调整后作为评价该方法检测效果的对照。试验结果表明,基于K205R基因的检测方法在检测模拟样品时扩增效率要优于基于p72的方法,而且敏感性和特异性强,适用于非洲猪瘟的快速检测、监测。     

转人溶菌酶基因奶牛多重PCR快速检测方法的建立

建立转基因奶牛多重PCR快速检测方法,为转基因动物及产品进出境检测技术平台的建立提供技术支持,并为转基因动物及产品检测技术标准的制定提供参考。根据牛物种特异性基因线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)设计奶牛内源性基因引物,根据外源基因人溶菌酶基因(human lysozyme,hLY)及标记基因新霉素磷酸转移酶基因(NPTⅡ)设计特异性引物,优化反应条件,建立转基因奶牛多重PCR检测方法。结果表明,建立的方法灵敏、快速、特异,一个反应可以检测多个基因片段,可有效用于转基因奶牛外源基因的检测。     

南非II型口蹄疫间接ELISA检测方法的建立

为满足口岸对南非II型口蹄疫检测、监测的需求,在对南非II型口蹄疫抗原表位分析及相关基因合成的基础上,进行融合蛋白pGEX—VP1-VP3的体外表达,采用柱上酶切方法制备VP1-VP3蛋白。将纯化VP1-VP3抗原包被96微孔板,分别优化抗原包被浓度、血清稀释度、酶标二抗稀释度,确定阴性临界值。经反复优化,建立的南非II型间接ELISA检测方法的最佳抗原包被浓度为6．4ug／ml,血清最佳稀释度为1：200,酶标二抗最佳稀释度为1：4000,阴性临界值（0D450）为0．562。检测样品判定标准为：OD450〉0．622为阳性,OD450〈0．502为阴性,0．502≤OD450≤0．622为可疑。特异性试验结果表明,所建立方法与其它血清型口蹄疫间无交叉反应。南非II型口蹄疫间接ELISA检测方法的建立为我国口岸口蹄疫检疫提供了新的查验方法。     

CRISPR/Cas12a技术在动物疫病检测方面的应用

CRISPR/Cas系统是由簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关蛋白(Cas)组成的一种基因编辑技术,可以特异地切割和识别靶标核酸基因。该技术具有检测速度快、灵敏度高和特异性强的优势,因此被广泛应用于动物疫病检测领域。本文就CRISPR/Cas12a结合等温核酸扩增技术和可视化技术在动物疫病检测中的应用进行综述,并对其应用前景进行展望,以期为我国的养殖业和进境动物疫病的监测提供技术支撑。     

球虫感染无菌鸡后甘露糖对沙门氏菌附着的影响

为了研究鸡感染柔嫩艾美球虫（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）后，盲肠上沙门氏菌的增加情况，我们调查了盲肠粘膜上甘露糖残留的数量变化。检验含２％糖类（Ｄ─甘露糖、Ｄ─半乳糖、Ｌ─岩藻糖、α─甲基糖苷）的磷酸盐缓冲液（ＰＢＳＳ）对鼠伤寒沙门氏菌在无菌鸡盲肠粘膜上附着的抑制作用。结果发现，在感染及未感染的鸡群中，Ｄ─甘露糖均能抑制鼠伤寒沙门氏菌的附着，却明显利于（Ｐ＞０．０５）类杆菌的附着，但对魏氏梭菌及嗜热巴氏杆菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）的附着无任何影响．镜检发现，在所采用的８种植物凝集素中，只有刀豆球蛋白Ａ（Ｃｏｎ　Ａ）和味精凝集素（ｌｅｎｓ　ｃｕｌｉｎａｒｉｓ　ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）能在盲肠粘膜表面呈现凝集反应为阳性的着色斑或点，从而表明盲肠粘膜表面有甘露糖残留存在。在Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ感染的鸡群中．损伤细胞的粗糙表面及隐窝底部，凝集反应明显呈阳性。结果表明，球虫感染可导致肠表面甘露糖残留增加，从而有利于更多沙门氏菌在肠道附着。     

巢式PCR检测隐孢子虫卵囊的研究

隐孢子虫病是一种重要的人畜共患原虫病。为了在临床样品中更准确、快速地检测隐孢子虫卵囊,从初步纯化的含有不同数量隐孢子虫卵囊的样品中和含有不同数量隐孢子虫卵囊的奶牛粪便中,直接提取DNA或用DNA纯化试剂盒对提取的奶牛粪便中卵囊DNA进行纯化之后用作起始PCR(Primary PCR)模板,以起始PCR的产物为模板进行巢式PCR(Nested PCR),用2对人工合成寡核苷酸分别作为两个PCR的引物,扩增片段大小分别为1325bp和820bp。优化了Mg2+浓度、引物浓度和dNTP浓度,并进行了特异性检验。建立的巢式PCR具有隐孢子虫属特异性,不仅扩增出新鲜样品DNA提取物中的目的片段,而且扩增出放置6年之久的DNA提取物中的目的片段。样品经过初步纯化之后,起始PCR和巢式PCR最低检测值卵囊分别为2 86×103个/ml和≤2 86个/ml;从含有隐孢子虫卵囊的奶牛粪便中提取DNA,尔后经过DNA纯化试剂盒纯化,其起始PCR和巢式PCR粪便中卵囊最低检测值分别为2 86×107个/g和≤2 86个/g。有望发展为试剂盒。     

非洲猪瘟病毒p54蛋白的表达及单抗制备

为制备非洲猪瘟病毒p54蛋白的单克隆抗体,本研究扩增p54蛋白的胞外区编码基因,分别克隆到p ET30a和p GEX-6p-1中,构建了p54-p ET30a和p54-p GEX-6p-1重组质粒;将质粒分别转化到大肠杆菌BL21中,表达C末端带6个His、N端带有GST的p54重组蛋白;利用亲和层析的方法,富集和纯化带His标签的p54蛋白;以带His标签的p54蛋白为抗原,免疫BALB/C小鼠,制备单克隆抗体;以带有GST标签的p54蛋白为抗原,对制备的单抗进行特异性验证。结果显示:大肠杆菌能高效表达带His标签和GST标签的非洲猪瘟p54蛋白;His标签的p54蛋白免疫BALB/C小鼠后,得到了3株单克隆抗体;Western blot结果表明,3株单克隆抗体能与带有GST标签的p54蛋白相互反应。本研究成功制备了p54的单克隆抗体,为进一步开展非洲猪瘟ELISA、Western blot和细胞免疫荧光检测技术的开发研究奠定了基础。     

蓝耳病病毒抗体ELISA检测试剂盒的“两步法”评价

本研究利用"两步法"对蓝耳病试剂盒进行了使用效果评价:第一步,利用18份参考血清对试剂盒进行初筛,淘汰检测准确率低的试剂盒;第二步,利用参考血清和临床样品,分别开展最低检测限、重复性以及诊断敏感性和诊断特异性分析。结果显示,A、B、C、D 4种市售试剂盒的初筛符合率均为100%,诊断敏感性和诊断特异性分别为94.58%和97.14%、94.58%和89.2%、93.1%和90%、96.55%和85%。其中,A和B为通用型试剂盒,能够检测欧洲型和美洲型蓝耳病;C和D均为美洲型检测试剂盒;重复性上,D试剂盒批内与批间变异系数都较小,重复性较好。本研究首次提出了"两步法"试剂盒评价体系并利用这一体系对4种蓝耳病试剂盒进行了评价,不仅为蓝耳病试剂盒的选择提供了依据,也为今后其它动物疫病检测试剂盒的评价提供了参考。     

真鲷虹彩病毒LAMP检测方法的建立

为建立一种检测真鲷虹彩病毒的环介导等温扩增(LAMP)方法,满足口岸、养殖场对该病的快速监测的需求,本研究比对分析了Gen Bank中公布的真鲷虹彩病毒基因组序列,筛选其主要衣壳蛋白MCP基因保守区序列,进行LAMP引物设计,建立了真鲷虹彩病毒LAMP检测方法。对扩增条件进行优化,确定最佳反应条件为62℃,45 min。灵敏度试验结果显示,该方法最低检测限为100拷贝/μL目的基因。特异性试验结果显示,该方法不与流行性造血器官坏死病毒(EHNV)、蛙病毒3型(FV3)、甲鱼虹彩病毒(STIV)发生交叉反应。结果表明,本研究建立的LAMP方法具有良好的敏感性和特异性。对5份疑似真鲷虹彩病毒感染的临床样品进行检测,发现检测结果与世界动物卫生组织(OIE)推荐的PCR方法检测结果符合率为100%。研究表明,本方法具有灵敏度高、特异性强,以及仪器设备简单、操作便捷、结果直观等优点,非常适合作为初筛手段,应用于养殖场、口岸等一线的疫病监测。