哲罗鲑胰岛素样生长因子-I的原核表达及活性鉴定

为进一步了解哲罗鲑IGF-I,实验采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,从哲罗鲑肝脏的总RNA中扩增出胰岛素样生长因子-I(IGF-I)的c DNA开放阅读框(open reading frame,ORF)序列。利用原核表达载体p S构建重组表达质粒(IGF-I/p S),并将其转化到宿主大肠杆菌Rosetta后经IPTG诱导获得重组哲罗鲑IGF-I蛋白。经SDS-PAGE电泳检测,在35~50 ku有条带与预期相符,且重组蛋白以包涵体的形式存在。包涵体经变性/复性实验后,获得纯化的IGF-I融合蛋白。ELISA鉴定结果显示,目的蛋白能特异性识别抗鱼类IGF-I抗体,表明获得了具有免疫活性的哲罗鲑IGF-I蛋白。细胞增殖实验(MTT法)结果显示,重组IGF-I蛋白对大麻哈鱼胚胎细胞(CHSE-214)、鲤上皮细胞(EPC)及虹鳟性腺细胞(RTG-2)均有显著促增殖作用,表明获得的重组IGF-I蛋白具有细胞水平的生物活性。本研究为深入了解IGF-I在哲罗鲑生长发育中的调控机制及绿色高效促生长制剂的研发奠定基础。     

烟酸诺氟沙星和乳酸诺氟沙星在松浦镜鲤体内的药动学比较

应用高效液相色谱(HPLC)技术研究以相同浓度(30mg/kg)烟酸诺氟沙星和乳酸诺氟沙星对松浦镜鲤Cyprinus carpio specularis口灌给药后,药物在试验鱼血液、肝胰脏、肾脏中的药动学特征。相同给药剂量下,烟酸诺氟沙星和乳酸诺氟沙星在松浦镜鲤血浆中的血药浓度和时间关系均为一级吸收二室开放模型,吸收半衰期(t_(1/2ka))分别为0.061h、0.043h,消除半衰期(t_(1/2β))分别为29.969h、14.972h,达峰时间(T_(max))分别为0.327h、0.272h,达峰浓度(C_(max))分别为6.247mg/L、13.423mg/L,药时曲线下面积(AUC)分别为53.015mg·h/L、89.907mg·h/L,表观分布容积(V_d)分别为4.347L/kg、2.084L/kg。结果表明:在相同给药剂量下,乳酸诺氟沙星的吸收和消除速率均快于烟酸诺氟沙星,药物种类显著影响药动学特征。     

氟苯尼考及氟苯尼考胺在鲤体内的残留

在水温(18±1)℃下,采用高效液相色谱串联质谱法研究了氟苯尼考及其主要代谢物氟苯尼考胺在体质量(100±10)g鲤(Cyprinus carpio)体内的代谢及残留规律,以制定休药期。实验鱼间隔24h按15 mg.kg-1体质量的剂量口灌给药,连续给药3次,在给药后0.5h、1 h、2h、4h、8h、12h、24h、2d、3d、5d、7d、10d、15d、20d检测肌肉、皮肤内氟苯尼考和氟苯尼考胺的含量。结果表明:氟苯尼考在鲤体内的代谢速度快,2~4 h出现峰值;肌肉中氟苯尼考和氟苯尼考胺的残留浓度高于皮肤,肌肉和皮肤中氟苯尼考的含量均高于氟苯尼考胺,皮肤中的代谢速度较快。按欧盟标准相应的休药期不少于2d,按日本标准则不少于10 d。     

一株传染性造血器官坏死病病毒的致病性研究

为了对分离于山东某虹鳟养殖场的一株传染性造血器官坏死病毒株(IHNV-Sn1203)进行致病性检测与研究,将该IHNV-Sn1203毒株进行虹鳟鱼苗人工回接感染实验。结果显示,8d内人工感染实验鱼累计死亡率高达100%。收集大批濒死的病鱼样本,制备病理组织切片;利用鲤上皮细胞(EPC)进行细胞感染实验、病毒电镜观察、空斑实验、病毒滴度检测和聚类分析。病理组织切片显示,该病毒可造成虹鳟造血器官广泛性坏死;细胞感染实验结果显示,接种24 h后EPC细胞出现葡萄串状典型细胞病变(cytopathic effect,CPE),72 h后大部分细胞崩解脱落形成网状孔洞;电镜下清晰可见弹状病毒粒子大量存在于细胞质内,其在EPC细胞上的滴度为108.36TCID50/mL,并能形成2~4 mm空斑。对病毒核蛋白氨基酸序列的聚类分析结果显示,该病毒与标准毒株RB-1和WRAC的同源性分别为97%和93%,与国内报道的zyx株具有最高的同源性(99%)。研究表明,IHNV-Sn1203毒株能够在鱼体及敏感细胞中稳定繁殖,产生典型病变,具有较高的病毒滴度,对虹鳟鱼苗有很高的感染性和致死性。     

鲟鱼病毒性疾病研究进展

鲟鱼是一种有着较高经济及科研价值的稀有、大型鱼类。但近年来,一些危害较大的流行性疾病的发生,给鲟鱼养殖业带来了巨大的经济损失。前期研究发现,病毒性疾病所占比重较大,是造成鲟鱼苗种大批死亡的重要原因之一。高首鲟虹彩病毒,高首鲟疱疹病毒-Ⅰ,Ⅱ和铲鲟虹彩病毒是已知引发鲟鱼病毒性疾病的主要病毒。本文针对这四种病毒病的临床症状、疾病的诊断方法、病原分离的方法以及该病的预防、治疗方法等研究进展进行概述。     

香菇多糖提取物体外抗IHNV的机制

本研究以虹鳟性腺细胞(rainbow trout gonad cell,RTG)为细胞模型,采用MTT法体外测定香菇多糖提取物的细胞毒性及其对传染性造血器官坏死病毒(IHNV)直接灭活、预防与生物合成的影响,探讨香菇多糖提取物抗IHNV的作用机制。结果显示:香菇多糖提取物对RTG细胞没有毒性作用。浓度为100μg/m L时,香菇多糖提取物对IHNV的直接灭活能力为52.48%,预防效果为50.38%,抑制IHNV生物合成的能力达84.41%。结果表明:香菇多糖提取物具有一定的抗IHNV作用,该作用主要与抑制IHNV在细胞内的生物合成有关。     

虹鳟传染性造血器官坏死病核酸疫苗工程菌发酵工艺研究

急性传染性造血器官坏死病(infectious hematopoietic necrosis,IHN)严重威胁虹鳟Oncorhynchus mykiss养殖业,造成严重的经济损失,核酸疫苗已成为虹鳟IHN疾病预防的研究热点。本研究首先检测虹鳟IHN核酸疫苗工程菌的遗传稳定性,结果显示工程菌在连续培养30代后,仍能保持稳定的质粒拷贝数。质粒酶切结果表明:连续培养30代后的质粒依然保持良好的完整性。在筛选高拷贝工程菌的基础上,又研究核酸疫苗的高密度发酵培养基、补料及发酵时间。结果表明:最优的发酵培养基配方为:1.2%胰蛋白胨(Tryptone)、2.4%酵母提取物(Yeast Extract)、0.5%甘油、0.017 mol·L~(-1)KH_2PO_4、0.072 mol·L~(-1)K_2HPO_4;补料配方为:3%胰蛋白胨、1.5%酵母提取物、50%甘油,最佳发酵时间为16h。本研究可为虹鳟IHN核酸疫苗的规模化生产提供参考。     

摄食不同喹乙醇水平饲料的鲤鱼肠道菌群的变化

本文研究了饲料中不同水平喹乙醇对鲤鱼肠道菌群数量及组成的影响。设计6组不同喹乙醇含量的饲料(0、200、400、800、1600和3200mg/kg)，对鲤鱼进行84d的饲养试验。试验结束时，各组随机取2尾鱼，分别对其前、中、后肠的细菌数量和组成进行了分析。结果发现：与对照组相比，投喂喹乙醇的试验组鱼肠道菌群数均有不同程度的下降，其中1600、3200mg／kg组的下降最为明显。从1600mg／kg开始前肠菌群数明显下降，在400mg/kg时中肠菌群开始下降较为明显，后肠菌群数在各试验组均呈下降趋势。在对照组检出的7种主要菌群也是构成各个实验组鱼肠道中的主要菌群，但这7种菌群在各组中的组成比例不同，其中鲤鱼肠道菌届中Aer属、Aci届的组成比例变化较大，800mg/kg(11．06％)、1600mg/kg(11．735％)和3200mg／kg(7．40％)组中Aer所占比例明显低于对照组(26．255％)，而800mg／kg(37．502％)、1600mg/kg(36．52％)和3200mg／kg(41．357％)组中Aci所占比例明显高于对照组(13．213％)。饲料中添加不同水平的喹乙醇可明显影响鲤鱼肠道主要菌群的数量及组成比例。     

虹鳟肠炎红嘴病病理模型的构建

为探讨鲁氏耶尔森菌侵染虹鳟的致病机制,本实验建立了鲁氏耶尔森菌感染虹鳟引起的肠炎红嘴病的病理模型,制定相应的临床症状及组织病理学评分系统,并对该模型进行研究。将43尾平均体质量约为12 g的健康虹鳟随机分成5组:3个实验组(n=30)、对照组(n=10)和哨兵组(n=3)。3个实验组分别采用2.0×106、2.0×107和2.0×108 CFU/m L的鲁氏耶尔森菌感染浓度,通过腹腔注射方式进行人工感染试验。对感染鲁氏耶尔森菌的虹鳟肠、肝脏、脾脏和肾脏组织进行镜检及临床症状、剖检病变判断,结合细菌学检测,按制定的评分系统评价各组肠炎红嘴病造模效果,确定最佳造模方案。结果显示,各攻毒组虹鳟感染后72 h均出现不同程度死亡,临床症状表现为红嘴、肛门红肿、鳍(胸鳍、腹鳍、臀鳍)等出现不同程度充血,下颌部、腹部出现出血点等。组织病理学可见肝脏、脾脏、肾脏及肠组织均有炎性细胞浸润现象出现,肝细胞、肠上皮细胞和肾小管上皮细胞等实质细胞变性、坏死,脾脏部位淋巴细胞减少、红细胞死亡堆积。综合各组得分发现,2.0×107 CFU/m L组的鲁氏耶尔森菌感染虹鳟造模效果最佳,患病虹鳟的临床症状显著且组内差异较小,病程迁延较长,便于研究。研究表明,对体质量约12 g的虹鳟幼鱼腹腔注射0.1 m L浓度为2.0×107 CFU/m L的鲁氏耶尔森菌可成功构建肠炎红嘴病病理模型。     

大蒜素在鲤、鲫血浆中的药物代谢动力学研究

建立鲤(Cyprinus carpio specularis)、鲫(Carassius auratus)血浆中大蒜素含量的气相色谱检测方法,并研究大蒜素在鲤、鲫体内的药物代谢动力学特征。对鲤、鲫以7.5 mg/kg的剂量单次口灌大蒜素,于停药后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、12、24、36、48、72 h采集血浆,采用气相色谱法(GC)检测药物含量,通过DAS3.0软件分析药动学参数。结果显示:二烯丙基二硫醚(DADS)和二烯丙基三硫醚(DATS)的最低检测限均为10 ng/m L,DADS、DATS在鲤血浆中的平均回收率分别为77.05%~97.98%、73.39%~108.51%,在鲫血浆中的平均回收率分别为87.05%~95.68%、83.69%~102.75%。药物的两种主要成分在健康鲤鲫体内吸收较完全,分布广泛,DADS较DATS吸收快,消除慢。