国内养殖鱼类和进境鱼卵中传染性造血器官坏死病毒(IHNV)的检测及基因分析

用传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)的反转录聚合酶链及该方法在来自国内养殖场的患病牙鲆和虹鳟及进口的匙吻鲟鱼卵中检测出IHNV,同时对扩增出的IHNV的DNA片段进行了序列分析。结果表明,从国内养殖的牙鲆和虹鳟中分离出的IHNV与IHNV的标准株RB-1株在序列上都具有98.1%的同源性,推导出在氨基酸序列上分别具有97%和99%的同源性。从进口匙吻鲟鱼卵中分离的IHNV与RB-1株在序列上都具有92.5%的同源性,推导出氨基酸序列有93%的同源性。系统发育树分析结果表明,从国内发病的养殖虹鳟中分离出的IHNV与进口匙吻鲟鱼卵中检测到的IHNV在进化上关系较为密切。     

患病北极红点鲑的病原分离与鉴定

对2004年5月四川省某养殖基地养殖的北极红点鲑患病鲑进行了病理学检查和病原分离,从病灶处分离到细菌和真菌。分离到的细菌经API生化鉴定为杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(Aeromonas salmonicidasubsp.salmonicida)。用引物AP1和AP2对纯化后的细菌进行PCR扩增,结果扩增出长度为421 bp的DNA片段,对扩增片段进行克隆、测序,用NCBI-BLASTn在GenBank中搜寻相似序列,结果与杀鲑气单胞菌各株A层蛋白部分编码基因有99%以上的序列同源性。用引物EUS-F和EUS-R对分离到的真菌进行PCR扩增,结果扩增出长度为755 bp的DNA片段,对扩增片段进行克隆、测序,用NCBI-BLASTn在GenBank中搜寻相似序列,结果与水霉属各株的DNA片段(包括18S核糖体RNA基因部分序列、内转录间隔区1全序列、5.8S核糖体RNA基因全序列、内转录间隔区2全序列和28S核糖体RNA部分序列)有93%-100%的同源性;而与属于丝囊霉菌属的EUS各株相对应的DNA片段仅有60%的序列同源性。因此判定所分离的真菌为水霉。杀鲑气单胞菌是引起疖疮病和溃疡病等病的病原菌,而水霉广泛存在于水中,当鱼受伤后,水霉孢子容易从患病部位侵入鱼体,加重感染。因此判断该病主要是由杀鲑气单胞菌引起,而水霉则引起继发感染。     

鲤春病毒单克隆抗体的制备

鲤春病毒血症（Spring Viraemia of Carp，SVC）是鲤科鱼类的一种急性、高致死率的传染病，被国际动物卫生组织（OIE）列为必须申报的疫病之一。1971年欧洲人首先报道了鲤春病毒血症，有资料记载，该病曾给欧洲中部和东部的鲤鱼养殖业造成巨大的经济损失。2002年4月美国北卡罗来纳州某养殖场的135000尾锦鲤暴发传染病，发病率达10％，同年6月美国威斯康星州的野生鲤鱼也大量发病。随后确认两起疫病病原均为鲤春病毒（SVCV），经OIE设在英国的OIE参考实验室鉴定表明，该病毒株与1998年英国从中国进口的金鱼中分离到的SVC病毒株一致，并称之为“中国株”。此举直接把美国SVC病毒株的来源指向中国，对中国活鱼尤其是观赏鱼的出口构成了重大威胁。     

传染性造血器官坏死病毒糖蛋白抗血清的制备及应用

应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从传染性造血器官坏死病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV)感染的细胞悬液克隆病毒的糖蛋白基因,将其亚克隆至原核表达载体pCWori,转化到大肠杆菌DH 5α,通过发酵大肠杆菌制备病毒糖蛋白.经SDS-PAGE分析,诱导表达的重组蛋白主要以包涵体的形式存在,使用Ni-NTA亲和层析柱在变性条件下进行纯化并透析复性,最终得到了较高纯度的可溶性糖蛋白,分子量约为57 kDa.Western-blot分析结果显示,所表达的蛋白能够被IHNV病毒制备的兔抗IHNV血清识别.用复性后的蛋白免疫小鼠制备抗血清,ELISA显示抗体效价可达1∶64 000.经制备的抗血清可以作为一抗建立ELISA检测方法,用于检测细胞悬液的病毒粒子,将抗血清稀释到1∶16 000仍能与IHNV全病毒发生反应.本研究利用重组的IHNV糖蛋白成功制备了高效价的抗血清,并能够与IHNV全病毒发生特异性结合,为IHNV免疫学检测方法建立奠定了基础.     

出口冻虾检疫

随着养殖业的发展,对虾的出口量与日俱增,最近两年,仅深圳赤湾港经我局检疫出口的冻虾就有15批次、410.94吨。现将我们在出口冻虾检疫中的临床观察和原因分析介绍如下: 1、冻对虾躯体黑变 黑变部位有时见于冻虾甲壳前、中部,斑点状,某些颜色稍浅,介于褐色至黑色之间;有时见于肌肉组织,严重的整块溃疡变黑,轻微的黑色呈线状或点状分布。解剖镜下观察,某些腐烂处如烧焦状。上述黑变症状,一般每一冻块虾中(2kg或2.5kg)平均为2—3尾。黑变的原因有二:一是对虾本身感染疾病,病因多种多样,如对虾褐斑病、弧菌病、镰刀菌病以及一些尚未明确病因的疾病     

鱼类病毒性神经坏死病毒的分离和部分特性研究

收集福建某渔场的患病石斑鱼苗制备组织切片,同时将患病石斑鱼苗组织匀浆后接种到条纹月醴细胞系(striped snakehead, SSN-1),对发生细胞病变(cytopathic effects, CPE)的SSN-1细胞进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、纯化负染,并制备细胞超薄切片,借助SSN-1细胞系从患病石斑鱼苗中分离病毒性神经坏死病毒(viral nervous necrosis virus, VNNV).试验结果表明:在病鱼脑和视网膜中可见大量的空泡,接种SSN-1后2～3d出现CPE,PCR检测可扩增出VNNV特异性带,提示这是VNNV病毒.负染及SSN-1细胞超薄切片的电镜观察显示,该病毒为直径25～30nm的二十面体病毒粒子,在胞质中呈不完全晶体状排列,同时细胞质中有大量空泡,进一步说明分离株为VNNV.对该分离株进行细胞敏感性试验、脂溶剂敏感试验(氯仿处理)、热敏感试验(55℃ 30min)、酸碱敏感试验(pH值为3和pH值为11各1h),试验结果表明:石斑鱼吻端细胞、鲤上皮瘤细胞、肥头鲤细胞在28℃、25℃、20℃时对该病毒都不敏感;该病毒对氯仿不敏感,对热和酸碱都比较敏感.研究结果表明,用SSN-1细胞系可以从患病鱼中分离VNNV.     

石鲽鱼鱼苗中一种弹状病毒的分离与鉴定

从养殖石鲽鱼(Kareius bicoloratus)鱼苗中分离到1株弹状病毒(080113株).用研磨离心除菌后的组织匀浆液,接种11种鱼类细胞系.结果在鲤上皮瘤细胞(EPC)和肥头鲤细胞系(FHM)等8种细胞中均出现明显的细胞病变(Cytopathic effect,CPE),在鲤上皮瘤细胞(EPC)中的滴度最高.对该毒株的理化性质进行了测定,结果显示080113株对温度和pH敏感;对5′-碘-2′脱氧尿密啶(IUDR)不敏感;对氯仿敏感,提示是一种有囊膜的RNA病毒.制备电镜超薄切片,观察到在细胞质中有大小为(80～118)nm×(28～55)nm、形态为典型的弹状的病毒粒子.SDS-PAGE电泳分析该毒株的蛋白质图谱,结果表明该毒株有5条主要的蛋白带,相对分子质量大小分别为200 000、56 000、42 000、29 000和24 000.用传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、病毒性出血性败血症病毒(VHSV)和牙鲆弹状病毒(HRV)等水生动物弹状病毒特异性引物对该毒株进行逆转录聚合酶链式反应,结果用HRV的引物能扩增出阳性片段.对该片段进行测序分析,发现与HRV的参考序列有99%以上的相似性.因此,初步鉴定该毒株为牙鲆弹状病毒.