血清素在斑节对虾催熟过程中的作用

在斑节对虾 Penaeus monodon 催熟催产过程中,常用的方法是切除眼柄.此实验选用体重为149.5±25.8 g的自然海区斑节对虾,比较了注射血清素(serotonin)和切除眼柄2种处理方法对斑节对虾的催熟效果.血清素注射剂量为50 μg·g -1体重,在实验的第1、5和10天注射,共计3次.结果显示,2种方法处理后,受试亲虾性腺指数(gonad somatic index,GSI)显著高于对照组,同时注射血清素的实验组亲虾的存活率及其卵子孵化率显著高于切除眼柄的实验组.实验结果表明,血清素对斑节对虾催熟有促进作用,但发挥效应所需要的时间较长;从切除眼柄手术到第一次产卵所需时间较短,但是手术后的亲虾死亡率较高.     

不同生长阶段斑节对虾消化酶活性变化

通过对斑节对虾不同生长阶段蛋白酶、脂肪酶及淀粉酶活性变化的分析,探讨了斑节对虾在生长过程中对蛋白质、脂肪和碳水化合物的消化利用。结果表明,根据消化酶活性,可将斑节对虾生长分为两个阶段。第1阶段,在体长10～12.5 cm阶段之前,随着个体的增大蛋白酶和脂肪酶活性不断升高;第2阶段,在12.5 cm之后,蛋白酶和脂肪酶活性呈现出一定程度的下降。肝胰腺、胃、肠3种不同消化器官的消化酶活性在不同生长期也不一致,大致上蛋白酶活性从高到低依次为:肝胰腺>胃>肠;脂肪酶活性:肠>肝胰腺>胃;淀粉酶活性:肠>胃>肝胰腺。     

斑节对虾钙网蛋白基因cDNA克隆和表达分析

采用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNAends,RACE)获得了1 672 bp的斑节对虾钙网蛋白(Penaeusmonodon calreticulin,PmCRT)基因cDNA序列。该序列包含37 bp的5’非编码区(UTR)和414 bp的3’非编码区(UTR)以及1 221 bp的开放阅读框(ORF),可编码406个氨基酸。预测的分子量约为46.8ku,理论等电点为4.13。序列比对分析表明PmCRT与中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)的相似性和同源性最高,分别为100%和98.8%。实时荧光定量PCR对组织表达检测的结果可知,PmCRT的mRNA在卵巢、肝胰腺、肌肉、脑、心脏、胃、眼柄和肠均有表达,卵巢的表达量最高,肌肉次之;对卵巢发育6期变化检测可知,PmCRT的mRNA在Ⅲ期卵巢表达量最高,Ⅰ期的表达量最低。以期为进一步研究该基因在斑节对虾卵巢发育中的作用提供基础数据。研究亮点:目前对斑节对虾卵巢发育的分子调控机理还知之甚少,有大量卵巢发育相关基因还不为人所知。本文研究了钙网蛋白在斑节对虾卵巢发育各期的表达谱,为阐明斑节对虾卵巢发育分子调控机理提供基础数据。     

斑节对虾MKK4基因的表达分析

从斑节对虾(Penaeus monodon)卵巢组织cDNA文库中筛选并获得了斑节对虾MKK4基因的cDNA片段,然后采用荧光定量的方法研究了MKK4基因在雌雄个体不同组织、卵巢不同发育阶段及未成熟和成熟精巢的差异表达情况。结果表明,MKK4的mRNA在各组织中都有表达,其中在未成熟精巢中表达量最高,其次分别为雌、雄个体的肠。在精巢不同发育阶段,其在未成熟精巢的表达量极显著高于成熟精巢。对卵巢不同发育期的研究表明,从Ⅱ期开始,随着卵巢的发育,MKK4mRNA的表达量逐渐增加,到第Ⅵ期时表达量达到最高。而在Ⅰ期的表达量虽高于Ⅱ期和Ⅲ期、低于Ⅳ期,但其与其他3期均无显著差异。     

斑节对虾C1q结合蛋白(PmC1qBP)的克隆及表达特征分析

Clq结合蛋白(ClqBP)是补体系统中的一种重要成分,它能与游离的补体分子Clq的胶原样区相互作用并启动多种细胞反应,包括增强吞噬作用、促进吞噬细胞对微生物的杀伤、诱导趋化作用,从而增强生物体的免疫性.本实验从构建的斑节对虾(Penaeus monodon)卵巢组织cDNA文库中筛选并克隆了PmClqBP基因.为研究PmClqBP在斑节对虾中的生物学功能,采用半定量和荧光定量的方法研究比较了PmClqBP基因在雌雄个体不同组织及卵巢不同发育阶段的差异表达情况.结果表明:雌雄个体的PmClqBP基因在性腺、胃、血细胞、肠中表达量存在极显著差异(P＜0.01).同时,PmClqBP在无节幼体和蚤状幼体时表达量低,从糠虾幼体至卵巢发育成熟过程中表达量有所增加并趋于稳定,揭示PmClqBP斑节对虾卵巢发育过程的重要功能基因.应激实验结果表明,经脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激6h后PmClqBP在肝胰腺中的表达量极显著上调,提示PmClqBP参与了斑节对虾天然免疫应答,暗示其在斑节对虾先天性免疫调控中发挥着重要的作用.     

池塘养殖斑节对虾生长、发育与性成熟

为了解不同养殖条件下斑节对虾的生长、外生殖器发育、性腺发育及性成熟之间的关系,对其养殖进行跟踪调查研究.结果显示:①斑节对虾雌雄外生殖器官发育和头胸甲长呈线性关系;②不同养殖环境条件下,斑节对虾性成熟生物学最小型个体无显著差异.雄性精荚出现的生物学最小型个体为头胸甲长3.1 cm,体长11.1 cm,体质量20.0 g;雄性性成熟个体的头胸甲长3.7 cm,体长13.0 cm,体质量37.0 g.池养雌性斑节对虾的性成熟生物学最小型个体以纳精囊的发育完全(可与雄虾交配)为标志,其最小性成熟个体的头胸甲长4.3 cm、体长15.1 cm、体质量53.0 g,雌性性成熟个体为头胸甲长5.0 cm,体长17.0 cm,体质量75.0 g以上;③池塘养殖斑节对虾性成熟与日龄和养殖环境相关.鱼塭雄虾精荚出现的最早时间为日龄120 d前后,其性成熟日龄约为160 d;池塘养殖雄虾精荚出现的最早时间为日龄150 d前后,其性成熟日龄约为260 d.鱼媪雌虾最早交配发生在日龄165 d前后,性成熟日龄205～236 d,池养雌虾最早交配发生在日龄240～ 280 d,性成熟日龄295～360 d以上.     

斑节对虾Chitinase-2基因的克隆及其在蜕皮和幼体发育过程中的表达分析

研究以斑节对虾(Penaeus monodon)转录组获得的几丁质酶基因(Pm Chi)片段,运用RACE技术克隆了PmChi基因c DNA全长,命名为PmChi-2。PmChi-2基因c DNA全长2 050 bp,其中5'-非编码区(5'-UTR)144 bp、3'-UTR 319 bp和开放阅读框(ORF)1 587 bp,编码528个氨基酸。生物信息学分析显示,PmChi-2与其他甲壳动物Chi-2的相似性为78%~97%。实时荧光定量PCR结果显示,PmChi-2在蜕皮前期(D期)表皮中表达水平最高,在胃、鳃、腹神经节和眼柄中表达水平依次降低,在其他组织(肝胰腺、肠、肌肉、心脏)中几乎不表达。不同蜕皮阶段,PmChi-2在鳃、胃和表皮3种组织中的表达变化模式基本一致,均在蜕皮期(E期)表达量最低,而最高表达量在鳃中出现在蜕皮后期(A期),在胃和表皮中为D期。幼体不同发育阶段分析揭示PmChi-2 mRNA在幼体发育阶段的无节幼体到糠虾幼体第二期表达量维持在一个低水平,在糠虾幼体第三期PmChi-2 mRNA表达水平显著升高,在仔虾期又显著下降,推测PmChi-2 mRNA可能与斑节对虾幼体发育密切相关。研究结果表明PmChi-2基因可能在斑节对虾蜕皮以及幼体的变态发育中发挥重要作用,为深入研究斑节对虾几丁质酶发育调控提供了重要信息。     

斑节对虾cyclin G2基因克隆及不同刺激下的表达分析

细胞周期蛋白G2(cyclin G2)是细胞周期中的重要调控因子。该研究初步探讨斑节对虾(Penaeus monodon)细胞周期蛋白G2(Pmcyclin G2)在卵巢发育中的作用,利用RACE技术克隆获得4075bp Pmcyclin G2 c DNA全长,其开放阅读框(ORF)1161bp,编码386个氨基酸。利用荧光定量PCR技术研究了Pmcyclin G2组织表达模式,结果显示,Pmcyclin G2在斑节对虾的心脏、血淋巴、肝胰腺、卵巢等组织中均有表达,其中肌肉中表达量最高;卵巢发育不同阶段Pmcyclin G2的表达分析则表明,Pmcyclin G2在III期表达量最高;注射5-羟色胺(5-HT)能诱导卵巢Pmcyclin G2基因表达升高,多巴胺(DA)则抑制卵巢中Pmcyclin G2基因表达。利用原核表达技术获得了cyclin G2的体外重组蛋白,Western Blot分析证实重组蛋白为cyclin G2蛋白。此结果为进一步研究该蛋白的功能提供了条件。以上研究结果表明,Pmcyclin G2基因可能与斑节对虾卵母细胞发育有密切关系,该结果可为进一步探究斑节对虾卵巢的发育机理提供理论依据。     

3种来源的野生斑节对虾携带病毒情况调查

利用PCR方法,对2008年取自3个斑节对虾主产地（中国、泰国、非洲）的野生斑节对虾亲虾进行主要病毒病筛查。在所检测的210例野生亲虾样本中,均发现携带白斑综合征病毒（WSSV）、传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）或斑节对虾杆状病毒（MBV）的阳性样本,其中泰国来源的斑节对虾亲虾WSSV携带率最高,达到89.8%,而中国来源的斑节对虾亲虾IHHNV携带率最高,为8.8%。12例样本同时检测出WSSV和IHHNV（阳性率为5.7%）。该结果揭示3种来源的斑节对虾亲虾普遍携带WSSV和IHHNV,其中WSSV仍然是感染斑节对虾的主要病原。调查结果增进了对斑节对虾主产区野生亲虾健康状况的了解,并在一定程度上揭示了WSSV感染的新规律。     

转录因子Relish在斑节对虾不同发育阶段的表达分析

对克隆获得的转录因子NF-κB/Rel家族成员Relish基因在斑节对虾发育阶段的表达特征进行分析。所获的PmRelish是Relish基因的亚型之一,与凡纳滨对虾LvRelish高度相似,结构域组成相同,其中RHD、IPT和DD结构域均具有100%的同源性,ANK结构域的相似性也高达97.7%。NF-κB/Rel家族进化树分析显示,PmRelish与对虾、昆虫等节肢动物的Relish聚为一支,并与P105(NF-κB1)和P100(NF-κB2)最为相近。PmRelish的表达在4个幼体发育时期都存在显著性差异,其中糠虾阶段表达量最高。PmRelish在不同发育阶段的精巢和卵巢中的表达特征相似,即未成熟期的表达相对较低,其中PmRelish在10～12 cm体长雄虾精巢中表达量最高,卵巢中的表达则在成熟期(V期)最高,为卵原细胞期的14.3倍。