甘蔗富含甘氨酸蛋白基因(Sc-GRP)的克隆及其表达分析

本研究在对甘蔗(Saccharum officinarum)叶片全长cDNA文库测序的基础上,通过EST (expressedsequence tag)序列测定和生物信息学分析,获得了1个编码富含甘氨酸蛋白(glycine-rich protein,GRP)基因的全长cDNA序列,命名为Sc-GRP.生物信息学分析表明,该基因全长518bp,包含一个273bp的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),5'端非编码区(untranslated region,UTR)长58bp,3’端UTR长187bp,且在3’端UTR中有典型的加尾信号AATAAA和polyA结构.该基因编码长度为90个氨基酸的蛋白,其理论分子量为10.12kD,等电点为5.86.Sc-GRP中甘氨酸含量最高,达到13％,且包含明显的GGX和GX重复结构单元.Sc-GRP没有信号肽和RNA结合位点.定量PCR分析结果表明,该基因在成熟叶片中的表达量远高于其在心叶中的表达量.在甘蔗茎中,随着节间成熟度的增加,其表达量逐渐升高,但在成熟根中几乎没有表达.在铝盐胁迫下,该基因在甘蔗初生根中的表达先是升高,然后随胁迫时间的增加而下降.研究结果提示该基因定位于细胞质,参与细胞的渗透调节,本研究结果为该基因的功能解析及其在甘蔗分子育种上的应用积累了基础资料.     

甘蔗遗传转化的研究进展

综述了１０ａ来ＰＥＧ、电击、基因枪和农杆菌介导的方法应用于甘蔗遗传转化研究所取得的进展,并对影响甘蔗遗传转化效率的因素和今后的研究方向进行评述和探讨．     

甘蔗抗坏血酸过氧化物酶基因(ScAPX)的克隆及表达分析

抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)是清除活性氧(reactive oxygen species,ROS)的重要酶类.本研究对针刺接种黑粉菌(Sporisorium scitamineum)后的抗、感基因型甘蔗(Saccharum officinarum)进行APX活性测定.结果表明,甘蔗接种黑穗病菌48h内,抗病品种(崖城05-179) APX活性显著高于感病品种(柳城03-182) (P＜0.05).借助电子克隆技术,结合RT-PCR方法,从甘蔗中分离到一个APX基因,并命名为ScAPX(GenBank登录号:KJ7565501).生物信息学分析显示,ScAPX基因全长l 171bp,包含一个1 038 bp的完整开放阅读框,编码345个氨基酸.ScAPX编码的蛋白不含信号肽,推测其为非分泌蛋白,定位于线粒体基质和叶绿体基质中的概率分别为91.1％和88.7％.实时荧光定量PCR检测结果显示,ScAPX在甘蔗根、芽、叶、蔗皮和蔗髓中均有表达,为组成型表达基因,表达量在蔗皮中最高,叶中最低,前者是后者的19.7倍;在外源因子处理后0～48 h,ScAPX基因的表达受水杨酸(salicylic acid,SA)、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)、过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)、脱落酸(abscisic acid,ABA)、氯化钠(sodium chloride,NaCl)和聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)诱导,SA、MeJA和H2O2处理后的ScAPX 转录本积累量峰值较外源激素(ABA)和环境(NaCl和PEG)胁迫早.前者的ScAPX转录本变化呈现出胁迫初期积累量增加,达到峰值后又逐步下降的特点;在同样的测试时间(处理后24 h)内,ABA、NaCl和PEG处理后ScAPX转录本在达到峰值后未见下降.虽然在外源胁迫下,ScAPX表达量变化存在明显差异,但其表达均表现出正响应上述外源因子对甘蔗的胁迫.本研究为后续深入鉴定该基因的功能与进一步应用提供基础资料.     

甘蔗分离群体的分析及抗感黑穗病池的构建

以甘蔗杂交组合 Co10 0 1× Ya71- 374后代为供试材料 ,采用人工接种方法 ,对其黑穗病抗性的分离结果进行分析 ,并构建了抗、感池 .相关分析表明 ,除最短潜伏期与最终累计丛感率相关不显著外 ,其余病害流行参数间的相关均达显著水平 ;利用最长距离法借助病害流行参数对供试材料进行聚类 ,可较好地归为 5类 ,类内个体抗病性差异不大 ,类间个体抗病性差异明显 .系统聚类分析结果可进一步验证所构建的抗、感池     

甘蔗杂交后代黑穗病抗性评价与抗感池构建

为研究甘蔗杂交后代黑穗病抗性的遗传变异,构建抗病、感病近等基因池,配置了2个杂交组合,其中组合1为CP84-1198×科5,组合2为ROC20×桂糖73-167,对2个组合部分后代进行2次新植人工接种黑穗病抗性鉴定,调查并分析了5个病害参数的关系.相关分析结果显示,病害有关参数中,发病持续期(SSD)与最大累计丛感染率(IPmax)、最大累计茎感染率(ISmax)、病情消长曲线下的面积(∑AUDPC)存在极显著的正相关,IP_与最短潜伏期(LP)在不同作物季间重演性高.应用2个病害流行学参数SSD和LP以及3个病情指数IP_、IS_和∑AUDPC作为聚类指标,采用欧氏距离及最长距离法,对2个组合的杂交后代部分个体的抗性进行聚类分析,构建了2对遗传背景不同的抗、感黑穗病近等基因池,为后续研究奠定了基础.     

植物MYB转录因子的同义密码子使用偏好性分析

前人研究显示MYB（V-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog）转录因子对应答植物逆境胁迫等有重要作用,甘蔗MYB转录因子的研究报道并不太多。通过对与甘蔗亲缘关系近的禾本科作物玉米、高粱和水稻MYB转录因子基因家族的密码子使用偏好性进行比较分析。结果表明,3个物种的MYB转录因子的蛋白质序列上存在高度的保守性,仅有部分密码子使用不太一样,此外,分析还显示基因碱基组成有可能在一定程度上影响了密码子的偏好使用。     

甘露糖筛选系统的建立及在甘蔗转基因中的应用

用甘露糖作为筛选底物,对甘蔗品种福农95-1702外植体的再生进行研究,建立福农95-1702的甘露糖筛选体系;在甘蔗愈伤组织的继代、分化、生根三个阶段进行抗性筛选时,甘露糖占总糖的比例分别是60%、60%和30%。在以上筛选体系的基础上,将福农95-1702作为受体材料,通过基因枪轰击法,将含有cryIA(c)抗虫基因的基因表达盒与筛选标记基因(pmi)进行共转化,通过甘露糖筛选,最终获得26株抗性再生植株,经PCR检测,其中4株呈阳性。初步说明cryIA(c)基因已经整合到福农95-1702的基因组中,获得了4株转基因阳性甘蔗植株。     

适宜机械化作业宽行种植的甘蔗肥料效应

根据适宜机械化作业的行距要求。对4个肥料处理在3个甘蔗品种上的施用效果进行分析。结果表明：沿用现农民习惯施肥方式不仅投入大。而且在甘蔗前期发芽、蔗茎伸长、糖分积累、甘蔗及糖产量等各方面都表现最差,投入、产出效率低下;单纯施用专用肥在甘蔗伸长盛期之前效果最好,但后期有脱肥现象发生,宜适当加量或补施;生物有机肥＋追肥型专用肥的肥效缓释特点使得甘蔗后期不脱肥。尽管营养生长维持时间稍长。工艺成熟略晚,但总体的投入、产出比优于其他处理,具有很大的推广价值;不同品种的生长特点不同,产量构成的主因子也有所不同,应选择不同的肥料处理组合分类指导,进行科学的营养管理。     

碱裂解叶片两步快速制备PCR模板技术研究

广泛采用提取DNA作为PCR模板的方法主要有CTAB和SDS法2种,但步骤烦琐、耗时长。根据Taq酶储存液和PCR反应缓冲液所含K+离子、Cl-离子和Tween-20等成分,以0.05mol/LKOH为强碱裂解物、2%Tween-20为稳定剂配制碱裂解液,以0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)和2mmol/LEDTA为中和液,经加热裂解和中和两步制备PCR模板。以甘蔗叶片为材料,用新鲜配制含KOH和Tween-20的裂解液,将适量叶片放入一定体积的裂解液中加热裂解,再中和,形成裂解混合物。直接以裂解混合物为模板,甘蔗内源基因为靶基因,在优化KOH裂解浓度、模板体积、加热裂解时间以及添加适量聚合酶稳定剂的情况下,PCR反应稳定,重复性强。以有代表性的单子叶和双子叶植物叶片为材料,经过多种内源基因PCR反应的反复验证,证实了这种方法的广泛适用性。该方法通过两步制备PCR模板,无需DNA提取过程,使用材料少,可以实现活体PCR检测,为遗传分析和分子诊断提供简便、快速和高效的分析方法。