拟南芥液泡分拣蛋白AtVPS25调控植物生长素响应的功能分析

【目的】鉴定生长素胁迫条件下纯合突变体vps25的表型,获得拟南芥液泡分选蛋白AtVPS25的互作蛋白,并分析AtVPS25和其互作蛋白在生长素响应过程中的功能及其分子机制。【方法】根据“三引物法”鉴定突变体;通过观察拟南芥vps25突变体在外加生长素的培养基上的表型,鉴定AtVPS25的功能;以AtVPS25为诱饵蛋白,采用泛素分离系统筛选在拟南芥中与其互作的蛋白;利用酵母互作试验和双分子荧光互补试验（BiFC）验证AtVPS25与AtAIR12（for Auxin-Induced in Root cultures）的互作关系;鉴定AtVPS25和AtAIR12蛋白在植物细胞中的定位情况;采用Real-time PCR方法,分析在生长素处理条件下,部分生长素运输相关基因在拟南芥vps25突变体中的表达变化。【结果】Real-time PCR结果显示,10 μmol•L-1 IAA处理条件下,在野生型拟南芥（WT）中,AtVPS25的表达量随着胁迫时间的增长而增高,并在12 h达到最高,约为0 h的40倍,证明AtVPS25受生长素处理的诱导表达。利用泛素分离系统筛库获得AtVPS25的互作蛋白AtAIR12、AtVPS25与AtAIR12全长蛋白序列的酵母双杂交试验证明AtVPS25与AtAIR12互作。亚细胞定位试验证明AtVPS25定位在细胞膜和细胞质中,AtAIR12定位在细胞膜及叶绿体膜上。BiFC（双分子荧光互补）试验结果显示,AtVPS25蛋白与AtAIR12蛋白互作,并且互作位点在细胞膜和细胞质中。突变体鉴定获得纯合突变体vps25。vps25在0.1 mg•L-1 IAA条件下生长,表现为主根伸长受到抑制,并且相对同一条件下的WT的主根长度差异极显著（P＜0.01）,而同时侧根数无明显差异,这与已报道的air12-1突变体在生长素处理条件下的表型相似。10 μmol•L-1 IAA处理时,在WT背景条件下,AtAIR12的表达量对IAA响应明显,并且随着胁迫时间的增长而增高,在12 h时达到最高,约为0 h的80倍,证明10 μmol•L-1 IAA处理条件下,WT中AtAIR12表达量的变化趋势与AtVPS25完全相同。同时在vps25突变体背景条件下,AtAIR12的表达相对于WT受到抑制,在0-24 h表达量无明显变化。此外,在vps25突变体背景条件下,生长素输出载体基因AtPIN2相对于WT中表达量降低,生长素输入载体基因AtLAX2相对于WT中表达量提高。【结论】拟南芥液泡分拣蛋白基因AtVPS25受IAA诱导表达,参与调控植物主根的发育,AtVPS25可以与生长素响应蛋白AtAIR12在细胞质和细胞膜上互作,AtVPS25调控部分生长素相关基因的表达,AtVPS25通过调控这些下游基因的表达影响生长素在根部的响应。AtVPS25与AtAIR12的调控机制需要进一步深入研究。     

农作物基因设计育种发展现状与展望

基因组学、计算生物学、合成生物学等基础科学快速发展,生物技术、信息技术、人工智能等前沿技术交叉融合,催生了精准设计育种,驱动作物育种加速向精准化、高效化和智能化发展,成为新时期农作物种业竞争的热点。系统分析了国际农作物基因设计育种发展态势,明确我国农作物基因设计育种发展现状与面临的挑战,展望新时期我国农作物基因设计育种发展路径,为推动农作物种业创新发展提供参考。     

应用基因组原位杂交技术鉴定抗黄矮病小麦新种质

利用生物素（biotin-16-dUTP）标记的中间偃麦草（Thinopyrum intermedium）基因组DNA作探针,以未标记的普通小麦中国春基因组DNA作封阻DNA（blocking DNA）,对3个抗黄矮病小麦新种质的体细胞染色体进行分子原位杂交。结果表明：抗性源于L1的抗黄矮病小麦新种质Yw642为小片段易位系,含40条小麦染色体和2条小麦-中间偃麦草易位染色体,易位的中间偃麦草染色体片段位于小麦染色体的端部;染色体配对和抗性分析表明该种质为纯合易位系。抗性源于无芒中4的小麦新种质Hw240和Yw060遗传构成不同：Yw060为易位系,含40条小麦染色体和2条小麦-中间偃麦草易位染色体;Hw240为代换易位系,含38条小麦染色体、2条中间偃麦草染色体和2条小麦-中间偃麦草易位染色体。在这2个种质中,易位的中间偃麦草染色体片段均位于小麦染色体端部。     

共转化法剔除转基因小麦中的bar基因

利用PCR检测了268株转小麦黄花叶病病毒复制酶基因T3代植株,初步筛选出只含有功能基因(WYMV-Nib8基因)而不含有筛选标记基因(bar基因)的转基因小麦植株28棵,为转基因小麦的安全性种植提供了保障。同时对无标记基因的转基因植株进行了叶片涂抹除草剂验证,探讨了叶片涂抹除草剂结合目的基因PCR检测筛选无选择标记转基因植株     

拟南芥H~+_-焦磷酸化酶AVP1互作小GTP结合蛋白AtRAB的特性鉴定与功能分析

以拟南芥AVP1为诱饵,采用膜蛋白酵母双杂交系统筛选拟南芥cDNA文库,获得一个与AVP1互作的小GTP结合蛋白AtRAB。酵母互作试验表明,AVP1和AtRAB存在互作;双分子荧光互补实验(BiFC)证明,AVP1和AtRAB能在质膜和细胞核上发生相互作用。野生型拟南芥(WT)、AtRAB和AVP1的拟南芥突变体rab和avp1在高盐胁迫条件下,随着NaCl浓度的加大,突变体rab和avp1的表型变化相似,相对于WT都表现为根长缩短,侧根数减少;在低磷处理条件下,随着磷浓度的逐渐降低,2个突变体的表型相似,相对于WT同样表现为根长缩短,总根面积减少,侧根数减少;在相同磷浓度条件下,突变体rab对胁迫的反应比avp1强;在低钾处理条件下,随着钾浓度的降低,2个突变体的表型与在低磷胁迫处理条件下的表型相似。结果说明,AVP1和AtRAB可以在细胞膜和细胞核上相互作用,AtRAB能够影响植物对离子的吸收,AVP1和AtRAB的突变体在高盐、低磷和低钾等胁迫条件下表型变化相似,证明了2个基因都正向调控植物对高盐、低磷和低钾胁迫的反应,它们属于同一信号途径。     

谷子转录因子基因SiNAC45在拟南芥中对低钾及ABA的响应

NAC(nascent polypeptide-associated complex)转录因子在植物生长发育和非生物胁迫响应等过程中发挥重要的调控作用,目前,关于NAC转录因子参与耐低钾胁迫的研究报道很少。本研究在前期工作对低钾胁迫的转录组测序基础上,对筛选出的一个低钾胁迫下表达量上调的NAC类转录因子基因SiNAC45进行了深入研究。结果表明,SiNAC45基因全长1383 bp,编码461个氨基酸,分子量为50.7 k D,等电点为6.92。SiNAC45在20~100个氨基酸之间有一段NAM保守结构域。系统进化树结果显示,SiNAC45位于NAC基因家族的第1亚族。基因表达谱分析显示,SiNAC45主要在谷子根部表达,并且能够被低钾和ABA诱导表达。亚细胞定位结果显示SiNAC45定位于细胞核。基因功能分析结果显示,在不同浓度低钾处理下,和野生型拟南芥相比,SiNAC45转基因拟南芥的根长和植株鲜重显著增加,说明过表达SiNAC45可以提高转基因植物对低钾胁迫的抗性。下游基因表达分析结果显示,在SiNAC45转基因植物中两种重要的钾离子转运体基因AKT1和HAK1的表达显著提高,证明SiNAC45通过调控植物钾离子转运体基因的表达影响植物对低钾胁迫的耐性。种子萌发试验结果显示,SiNAC45转基因拟南芥与野生型拟南芥相比对ABA的敏感性降低,说明SiNAC45可能负调ABA信号。     

转TaEBP基因小麦的回交转育研究

本研究以转TaEBP基因的新春9号小麦T 4代株系为供体,通过回交育种的方法将与抗逆相关的TaEBP转录因子基因导入黄淮麦区的7个主栽或主推小麦品种中,利用温室快速加代和目的基因PCR分子跟踪检测技术,实现了一年四代的快速繁育,在一年内获得了转基因回交三代株系群。PCR分析结果显示,TaEBP基因在杂交F1代植株中阳性率平均在72.3%以上,在6个轮回亲本的回交后代中基本符合1∶1分离比率,在刑麦六号的BC3F2代中呈3∶1分离,外源TaEBP基因的分布符合一对显性等位基因扩增结果的遗传分离比例;PEG-6000胁迫条件下,对3个来自刑麦6号BC3F2代的回交导入系苗期抗性鉴定显示,3个转基因回交导入系的抗旱性明显提高。表明利用转基因材料通过回交转育、快速加代和分子跟踪检测是快速定向改良小麦品种的性状、获得新的转基因小麦的一条有效途径。     

W16转济麦19小麦株系抽穗期抗旱性研究

以两个转W16基因小麦株系及相应的受体对照品种为材料,在大田控水的条件下研究了水分胁迫对转基因小麦抽穗期相关生理特性的影响,利用方差分析方法对转基因株系的抗旱性进行了综合评价.结果表明:转基因株系和对照及受体有着较大的差异,随着水分胁迫的加剧,参试品种的相对含水量、气孔导度、光合速率、叶绿素含量呈下降趋势,转基因小麦的下降幅度较小;丙二醛含量、胞间CO2浓度、质膜相对透性呈上升趋势.受体对照品种的上升幅度大于转基因小麦;转基因小麦的脯氨酸含量显著高于对照品种.方差分析表明,转基因小麦株系G19-X51、G19-X61具有较好的抗旱性.     

白菜的内多倍化现象

研究和了解植物内多倍化现象的发生规律和特点对于有效调控器官分化过程, 加速有用器官形成具有重要意义。本文分别以白菜及其近缘属种为材料, 运用流式DNA分析技术, 系统检测了不同发育阶段、不同组织器官以及不同种属植物叶片的内多倍化水平。结果表明, 白菜的内多倍化特点同样具有组织、发育阶段和种属特异性。一些木质化程度较高的输导组织如幼根、胚轴、茎和叶柄比其他非输导组织的叶片、子叶、苞叶具有更高的内多倍化程度; 在给定的组织器官中内多倍化水平随该器官的发育进程而提高, 当器官成熟时, 内多倍化水平也趋于稳定; 显微观察结果表明, 不同倍性的细胞核大小差异悬殊, 呈无规律状态散布于白菜表皮组织相邻的细胞内; 最高倍性水平的细胞核, 在白菜叶片中为64C, 而在甘蓝、芥菜和拟南芥中分别为32C、16C、16C, 在同科的不同植物中显示了不同的内多倍化水平。     

大豆抗逆基因GmDREB3启动子的克隆及调控区段分析

GmDREB3基因能提高转基因烟草和拟南芥的抗逆性。利用SiteFinding-PCR技术, 从大豆品种铁丰8号基因组中分离到大豆抗逆基因GmDREB3启动子片段, 长度1 648 bp。该片段富含A/T碱基, 还含有TATA-box、低温响应元件MYC及其他顺式元件MYB、CAAT-box等。将该启动子分区段与GUS报告基因连接构建表达载体, 利用基因枪法转化小麦愈伤组织, 并进行干旱、高盐、低温等处理, 通过组织化学染色和GUS荧光定量测定分析各区段调控元件的活性。结果表明, 在干旱和低温的诱导下, 该启动子能激活下游GUS基因的表达, 在–285 ~ –1 117区域存在与低温和干旱应答有关的重要调控元件, 在–1 464 ~ –1 648区域内存在抑制启动子活性的调控元件。由此推断, 在逆境条件下通过启动子区域正、负调控元件的共同作用, 使GmDREB3基因的表达维持在一个恰当的水平。