中棉所12配制的2个杂交棉DNA甲基化遗传与传递

DNA甲基化在真核生物的生长发育过程中起着重要的调控作用。本研究用MSAP方法分析了中棉所12配制的2个杂交棉和亲本不同发育时期的基因组DNA 5′-CCGG位点胞嘧啶的甲基化水平及其遗传传递模式。研究表明: (1)杂交棉及其亲本不同发育时期的胞嘧啶甲基化水平不同,随着生育期的逐步推进,出现两头低而中间高现象;(2)两个杂交棉组合的DNA 甲基化总体水平为12.41%~20.05%,其中以内侧胞嘧啶全甲基化为主(约占6.90%~11.47%);(3)棉花中绝大多数CCGG胞嘧啶甲基化位点是由亲本稳定遗传给杂交种的,但杂交棉仍有1.14%~3.39%的位点显示了变异,其变异频率在不同亲本组合之间和不同发育时期都存在差异;(4)对甲基化差异条带测序分析发现,其功能涉及到富含亮氨酸重复、类PDR的ABC转运蛋白、GTP结合蛋白、病程相关蛋白、磷酸激酶、功能未知的蛋白质和反转录酶等,部分差异序列没有产生有意义的匹配。     

陆地棉产量相关性状的QTL定位

中棉所28和湘杂棉2号分别是以中棉所12×4133和中棉所12×8891配制而成的两个陆地棉强优势杂交种。以其F₂为作图群体,筛选6000多对SSR引物,利用两群体间27个共有多态位点,通过JoinMap 3.0软件整合了一张包含245个多态位点、全长1847.81 cM的遗传图谱。利用Win QTLCart 2.5复合区间作图法分别对两群体8个产量相关性状在F₂和F_2:3中进行QTL定位,在中棉所28群体多环境平均值的联合分析中检测到16个QTL,三环境分离分析中检测到43个QTL;在湘杂棉2号群体分别检测到20个和66个QTL。在A3、D8、D9等染色体上有QTL成簇分布现象,同时在两个群体中发现一些不受环境影响且稳定遗传的QTL。对考察的8个性状在两个群体中发现12对共有QTL,控制果枝数、衣分和籽指的QTL增效基因位点均来源于共同亲本中棉所12。综合分析推测中棉所12的育种价值主要是通过提高后代的结铃性来实现的。研究结果为棉花产量性状的分子设计育种提供了有用的信息。     

棉纤维发育相关基因时空表达与纤维品质的关联分析

以14个纤维品质差异的棉花品种(或品系)为材料,研究10个纤维发育相关基因时空表达变化与纤维品质的关系,为阐明棉纤维发育相关基因与纤维品质形成关系提供理论基础。利用实时荧光定量PCR技术检测10个基因在14个供试品种(或品系)不同纤维发育时期的相对表达量,结果表明,虽然遗传背景完全不同,但它们具有某些共同表达特征。GhExp1、GhCIPK1、GhSus1、GhSusA1和GhPL这5个基因都是在纤维伸长期优势表达;GhACT1、GhRacA和GhRacB是在纤维伸长前期和次生壁加厚期高表达;而GhCelA1和GhcelA3是在纤维伸长后期和次生壁加厚期优势表达。这些基因表达谱与纤维品质关联分析显示,GhRacA在23DPA高表达且表达量与纤维品质显著正相关,其余基因在低表达时其表达量与纤维品质呈显著性相关,而在高表达时其表达量与纤维品质无相关性。GhExp1在20DPA的表达量与纤维比强度和整齐度呈显著负相关,与伸长率呈极显著正相关;GhPL在23DPA的表达量与纤维长度呈显著负相关;GhRacA在5DPA和23DPA的表达量均与伸长率呈极显著正相关;GhRacB在10DPA的表达量与长度和整齐度呈显著负相关;GhCelA1基因在5DPA的表达量与纤维长度呈显著正相关,与马克隆值呈显著负相关,在10DPA的表达量与马克隆值呈显著正相关,与伸长率达到极显著正相关,与比强度呈显著负相关,与长度和整齐度呈极显著负相关;GhCIPK1、GhACT1、GhSus1、GhSusA1和GhCelA3 这5个基因在纤维发育各时期的表达量与纤维品质各指标未检测到相关性。     

陆地棉背景下海岛棉第18染色体片段置换系的培育及相关农艺性状QTL定位

Sub18是以陆地棉遗传标准系TM-1为背景, 含海岛棉3-79第18染色体的置换系材料。本研究以TM-1为受体亲本, 置换系Sub18为供体亲本, 借助分子标记辅助选择技术培育了一套以TM-1为背景, 含海岛棉3-79第18染色体不同长度片段的置换系。这套置换系由45个株系构成, 共78个置换片段。其中27个株系导入单片段, 占总株系的60%; 9个株系导入2个片段, 占20%; 9个株系导入3个及以上片段, 占20%。导入片段总长度为467.6 cM, 约为该染色体遗传长度的4倍, 每个株系内被替换的染色体片段长度不完全相同, 平均遗传长度为5.99 cM, 最短的为0.9 cM, 最长的20.35 cM。其中13个株系表现开放花蕾性状, 涉及的最短导入片段长5.05 cM。对TM-1、Sub18以及培育的45个导入系进行农艺性状调查和QTL联合定位分析, 鉴定出纤维强度(qFS-C18-1)、整齐度(qFU-C18-1)、马克隆值(qFMi-C18-1)、成熟度(qFMa-C18-1)、皮棉重(qLW-C18-1)、籽指 (qSI-C18-1)和衣分 (qLP-C18-1) 7个加性QTL和5个上位性效应QTL。研究结果为进一步精细定位目标QTL、克隆QTL以及重要性状分子设计育种奠定了基础。     

两个棉纤维发育相关基因的克隆与特征分析

棉纤维发育突变体是克隆棉纤维发育关键基因和阐明其发育分子机理的优异资源。陆地棉李氏超短纤维突变体(Li₁li₁)是显性单基因突变体,表现为显性纯合体(Li₁Li₁)致死,显性杂合时(Li₁li₁)表型为茎秆扭曲、叶片卷曲和纤维短至6 mm,而隐性纯合体(li₁li₁)则表现为株型和纤维发育都正常。本文对开花后10 d的李氏纤维发育正常材料(li₁li₁)和超短纤维突变体(Li₁li₁)胚珠纤维混合体进行mRNA差异显示反转录PCR(DDRT-PCR)分析,获得2条在李氏纤维发育正常材料中上调表达的差异片段。测序及DNA序列的生物信息学分析表明该差异片段分别与编码谷氨酸脱羧酶和质子焦磷酸酶的基因有较高同源性。通过电子拼接,5¢RACE和全长cDNA序列验证,克隆了棉花的谷氨酸脱羧酶(GhGAD)和质子焦磷酸酶(GhVP1)基因全长cDNA, 进一步对其功能和染色体定位进行了初步分析。转录水平分析表明,这两个基因在棉花根、茎、叶和纤维中组成性表达,在棉纤维中优势表达。利用本实验室陆地棉遗传标准系TM-1和海岛棉海7124培育的含140个单株的BC₁作图群体,将GhGAD和 GhVP1分别定位在第12条染色体和第8条染色体。     

棉花4个脂肪酸合成相关基因的克隆和表达特征分析

脂肪酸合成相关代谢在控制油的合成和抗非生物胁迫中均起着重要作用。其脂肪酸合成相关基因的时空表达水平直接影响油的含量和脂肪酸合成相关酶的活性。本研究克隆了4个脂肪酸合成相关基因,分别命名为GhKASII、GhKASIII、GhFAD和GhGPAT,其中GhKASIII、GhFAD和GhGPAT基因cDNA全长通过电子克隆和同源克隆得到。而GhKASII通过筛库和5'-RACE途径得到。组织表达分析表明, 上述4个基因在根、茎、叶及纤维发育不同时期均有表达,属于组成性表达基因。其中GhKASII、GhKASIII在25 DPA种子中表达量最高,GhGPAT在0 DPA胚珠和15 DPA纤维中表达量很高,GhFAD在0DPA胚珠, 15 DPA种子,20 DPA纤维中表达量均很高。不同非生物胁迫的诱导表达分析表明,上述4个基因均不同程度被茉莉酸甲酯,ABA,创伤和冷害等逆境诱导表达。     

一个新的棉花MYB类基因(GhTF1)的克隆及染色体定位分析

MYB类转录因子是指含有MYB结构域的一类转录因子, 广泛参与植物发育和代谢调节。含2个MYB结构域的R2R3类MYB转录因子在植物体内主要参与次生代谢的调节和控制细胞的形态发生。从优质材料7235不同发育时期的棉纤维混合cDNA文库中克隆了一个棉花MYB转录因子基因GhTF1(GenBank登录号: EF651783)。该cDNA序列长1 115 bp, 其开放读码框长度为771 bp, 编码256个氨基酸。表达特征分析表明, 该基因在陆地棉7235不同组织中均表达, 但表达量不同, 特别在开花前1 d, 开花后8 d和11 d的纤维细胞中优势表达。该基因在二倍体棉种非洲棉和雷蒙德氏棉中开放读码框区的序列较保守, 但在非编码区差异较大, 在内含子区存在大片段插失和碱基替换现象。Southern杂交结果表明该基因在陆地棉基因组中存在2个拷贝, 推测A、D亚组中各有1个拷贝。利用海7124和TM-1两亲本配置的BC₁作图群体, 将GhTF1定位在染色体10上。     

棉花腺苷高半胱氨酸水解酶cDNA的克隆、表达及染色体定位

腺苷高半胱氨酸水解酶是调节细胞内甲基反应的一个关键酶。通过对高品质纤维陆地棉品系7235的棉纤维混合cDNA文库随机测序, 得到一个棉花腺苷高半胱氨酸水解酶(编号: g073a03a,GhSAHH)的cDNA序列。该cDNA序列长1 598 bp, 利用5′RACE技术得到上游318 bp的片段,序列拼接获得全长为1 916 bp的cDNA序列, ORF为1 458 bp, 编码485个氨基酸, 其理论上的等电点pI＝5.69, 分子量MW＝53.2 kD。该基因在不同组织、器官中均表达, 在根、下胚轴和纤维发育早期优势表达。根据Southern杂交结果推测GhSAHH基因在陆地棉基因组中为单拷贝。利用本实验室陆地棉遗传标准系TM-1和海岛棉海7124培育的含140个单株的BC1作图群体, 将GhSAHH基因定位在第20号染色体上。     

陆地棉优质纤维QTL的分子标记筛选及优质来源分析

利用陆地棉优质品系7235、渝棉1号做亲本, 以7235 × 渝棉1号的F2与F2:3分离群体为材料, 开展不同来源棉花高强纤维QTL微卫星标记筛选, 为进一步进行优质纤维QTL聚合育种提供基础。通过5 514对SSR引物对亲本进行多态性筛选, 获得117个多态性标记, 用其中80个标记构建了总长为1 147.8 cM的遗传图谱; 应用复合区间作图法分析了该组合的F2单株和F2:3家系纤维品质性状, 共检测到36个纤维品质数量性状基因座(QTL), 其中与纤维长度、比强度、细度、伸长率及整齐度相关的QTL各6、8、7、8和7个, 分别解释各性状表型变异的3.4%~14.4%、5.0%~42.4%、6.5%~11.7%、5.1%~19.4%和6.9%~14.0%。通过分析来源于7235和渝棉1号高强QTL的染色体分布, 表明两亲本在D7、D8、D9染色体上都存在控制纤维比强度的QTL, 其中存在于D7和D8染色体上来自双亲的QTL紧密连锁, 成簇分布在染色体上的一定区间内。而在D7和D9染色体上也发现双亲完全相同的优质QTL, 其优质供体可能来自陆地棉优质品系PD4381。进一步分析了获得的QTL在聚合育种中的应用潜力。     

陆地棉衣分差异群体产量及产量构成因素

 以衣分差异较大的陆地棉品种为材料,构建了包含188个F₂单株的作图群体,应用6111对SSR引物对亲本进行了分子标记筛选,结果仅获得了123个多态性位点,其中88个位点构建了总长为666.7 cM、平均距离为7.57 cM的遗传图谱,覆盖棉花基因组的14.9%。通过复合区间作图法对F₂单株和F_2∶3家系进行QTL检测,共鉴定出了18个控制产量及产量构成因素变异的QTLs,包括2个衣分QTLs、4个子棉产量QTLs、4个皮棉产量QTLs、2个衣指QTLs、3个单株铃数QTLs、2个铃重QTLs和1个子指QTL。 解释的表型变异分别为\{6.9%\}～16.9%、5.6%～16.2%、4.8%～15.6%、7.7%～13.3%、8.2%～11.6%、6.1%～7%和6.6%。不同QTLs在相同染色体区段上的成簇分布表明与产量性状相关的基因可能紧密连锁或一因多效。产量及产量构成因素QTLs的遗传方式主要以显性和超显性效应为主。检测到的主效QTLs可以用于棉花产量及产量构成因素的分子标记辅助选择。