棉花航天诱变敏感材料的筛选及多态性分析

利用"实践八号"育种卫星搭载棉花10个品种(系),对SP1代、SP2代进行了突变体的筛选、DNA分子标记检测和田间农艺性状调查,研究棉花不同材料对航天诱变的敏感性。其中7个材料对航天有一定的敏感性,其分子标记多态性高,田间农艺性状变化明显。结果表明,太空能够诱导棉花种子发生基因变异,航天诱变可作为棉花种质资源创新和品种选育的方法之一。     

早熟抗虫棉新品种——中棉所84

中棉所84(原代号中夏杂08)是由中国农业科学院棉花研究所与生物技术研究所合作,以sGK中825为母本,以中416为父本配置杂交组合,杂交一代经产量、抗性和生化辅助育种选育而成,2008-2009年参加河南省短季杂交棉品种区域试验,2010年参加河南省短季杂交棉品种生产试验,获得在河南省的国家农业转基因生物生产应用安全证书[农基安证字(2010)第181号].     

一个短季棉芽黄基因型的鉴定及生理生化分析

 【目的】鉴定新的早熟棉花芽黄突变体,为揭示航天诱变机理和芽黄突变体的利用提供理论基础。【方法】以中棉所58芽黄突变体为材料与野生型、棉花中期库17份芽黄材料进行正、反交,通过遗传学分析、叶绿体的超微结构观察和抗氧化系统酶活性测定,比较中棉所58芽黄突变体Vsp与野生型的各性状差异。【结果】中棉所58芽黄突变体Vsp和野生型中棉所58正、反交F2叶色表现符合绿叶﹕黄叶为3﹕1的分离结果,说明该突变体的芽黄性状由隐性核基因控制,中棉所58芽黄突变体Vsp和其它17份芽黄材料正、反交,虽有材料杂交后代有极个别表现芽黄表型,但绝大部分（95%以上）都表现为正常绿色,说明控制中棉所58芽黄突变体Vsp芽黄性状的基因和其它17份已经鉴定的芽黄材料控制该性状的基因不等位。叶绿体的超微结构表明,芽黄突变体叶绿体发育存在一定的缺陷,发育比较滞后,基粒类囊体和基质类囊体垛叠数较少,排列比较混乱,但随着叶片的不断发育,之后逐渐达到野生型的发育水平。芽黄材料的株高、果枝数、大铃、小铃、产量和纤维品质显著低于对照,芽黄突变体的SOD和CAT活性低于对照,POD活性高于对照,说明其抗氧化能力远低于对照。【结论】利用航天诱变技术,经过多代连续自交,获得芽黄性状稳定遗传且不同于棉花中期库17份已有芽黄材料的芽黄突变体中棉所58Vsp,该芽黄性状受一对隐性核基因控制;该芽黄突体的抗氧化系统酶活性、色素含量、叶绿素合成前提物质及叶绿体的超微结构均受到一定的影响。     

棉花转录因子GhWRKY11的克隆及功能分析

短季棉(Gossypium hirsutum)的早熟往往伴随着早衰,挖掘和鉴定衰老相关基因对于选育早熟不早衰棉花新品种具有重要意义,而WRKY转录因子广泛参与调控植物衰老过程.本研究克隆了陆地棉WRKY转录因子GhWRKY11(GenBank accession No.JN604988),cDNA全长1 055 bp,包含1 008 bp开放阅读框(open reading frame,ORE),编码335个氨基酸,属于WRKY转录因子Ⅱd亚组.蛋白序列系统进化分析表明,GhWRKY11与拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtWRKY11的相似度较高.基因结构分析表明,Gh WRKY11基因有3个外显子和2个内含子.亚细胞定位结果表明,GhWRKY11蛋白定位在洋葱(Allium cepa)表皮的细胞核.qRT-PCR结果分析表明,Gh WRKY11在盛花期的棉花叶片中优势表达,在子叶衰老过程中表达下调.赤霉素(gibberellin,GA3)处理棉花幼苗后,GhWRKY11在2、4、8和12h的表达显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)上调;水杨酸(salicylic acid,SA)处理后,GhWRKY11的表达量随处理时间的增加而逐渐升高,并且在2、4、8和12h的表达极显著(P＜0.01)上调;同时,GhWRKY11可以在某些时间点被脱落酸(abscisic acid,ABA)、乙烯(ethylene,ET)、H2O2和茉莉酸(jasmonic acid,JA)诱导表达上调.GhWRKY11在受到低温(12℃)胁迫处理时表达上调,且在2、8和12h达极显著(P＜0.01);盐胁迫(200 mmol/L NaCl)处理后,GhWRKY11在2、4、8和12 h的表达显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)上调;15％聚乙二醇6000(polyethylene glycol 6000,PEG6000)处理后,在12h的表达量极显著(P＜0.01)上调;损伤处理对该基因的表达没有显著影响.播种45 d后,与野生型拟南芥相比,GhWRKY11拟南芥过表达植株衰老延缓,由此推断,GhWRKY11可以延缓植株衰老,初步鉴定GhWRKY11是衰老的负调控因子.该基因的克隆和功能的初步分析为创制转基因抗早衰棉花材料提供基础资料.     

陆地棉转录因子GhNAC7的克隆及功能分析

【目的】从陆地棉中克隆GhNAC7,分析其结构和功能,研究其在棉花不同组织中以及叶片不同发育时期的表达量。并转入拟南芥进一步探究其在棉花叶片衰老过程中的作用。【方法】利用中国农业科学院棉花研究所棉花生物学国家重点实验室建立的棉花衰老叶片cDNA文库中的序列,获得1个含有NAM结构域的EST,使用Oligo6.71设计引物,重新在陆地棉叶片cDNA中进行克隆。使用Gene Structure Display Server软件分析GhNAC7结构,使用在线工具Plant CARE分析启动子序列,利用在线工具Gen Scan进行氨基酸序列翻译。同时,利用拟南芥基因组数据库(TAIR)进行序列比对,选取得分较高的NAC家族基因,使用MEGA 6.06软件和Gene Doc软件进行进化树分析和氨基酸比对。以XbaⅠ和SacⅠ为酶切位点构建35S::GhNAC7-GFP融合表达载体,分析其在洋葱表皮细胞中的瞬时表达,进行亚细胞定位。利用实时荧光定量PCR技术分析GhNAC7在棉花不同组织、不同叶片发育时期以及在200μmol·L~(-1) ABA调控下的表达量。通过构建p GhNAC7-GUS融合表达载体并转拟南芥,分析其启动子特异性。以Eco RⅠ和SalⅠ为酶切位点,利用p BI101和p BI121载体,分别构建融合表达载体并转拟南芥进行过表达分析。【结果】从陆地棉中成功克隆GhNAC7,其全长为1 064 bp,包含3个外显子,2个内含子。生物信息学分析结果表明,GhNAC7开放阅读框为834 bp,可编码277个氨基酸,其蛋白质分子量为31.35 k D,等电点为9.22。结构域分析表明其属于NAC转录因子的NAM亚家族,进化树分析显示GhNAC7与ANAC041、ANAC083同源性最高,其中,GhNAC7与ANAC083结构域位置均为17—58 aa。其启动子核心元件包含一系列与衰老、激素、胁迫相关的顺式作用元件。亚细胞定位表明其蛋白为核蛋白。组织特异性表明GhNAC7在真叶、子叶、花、花药和衰老真叶中均明显表达,其中在衰老的真叶中表达量最高。启动子特异性分析表明,其GUS活性在衰老的叶片中最强。在拟南芥中过表达该基因,转基因植株比野生型表现出明显的衰老症状。荧光定量PCR分析表明,ABA处理后6 h GhNAC7明显上调表达,并在48 h表达量达到最高,这表明ABA可调控GhNAC7表达从而调节棉花叶片衰老。【结论】GhNAC7可以促进棉花叶片衰老并受ABA的调控。     

陆地棉开花相关基因GhFLP5的表达及功能分析

【目的】克隆陆地棉开花促进因子家族的一个基因Flowering Promoting Factor1-like Protein 5(Gh FLP5),并对其时空表达模式进行研究,解析其在开花调控过程中的作用,为创制早熟陆地棉材料奠定基础。【方法】根据NCBI数据库中的序列,用Oligo7软件设计引物,以中棉所50(CCRI50)的c DNA为模板,克隆获得Gh FLP5。在Ex PASy网站上预测其蛋白的理化性质,同时在NCBI中检索其他物种中的FPF蛋白,使用Clustal X2进行多重序列比对,并用MEGA6构建系统进化树;取陆地棉早熟品种CCRI50和中晚熟品种鲁棉研28(Lu28)不同生长时期、不同组织的样品,对Gh FLP5的时间和空间表达模式进行分析;从基因组数据库中调取Gh FLP5起始密码子上游1 500 bp的片段,用Plant CARE在线工具预测其顺式作用元件,选取相关激素对二叶期棉花幼苗进行叶面喷施处理,研究Gh FLP5的应答反应;构建植物表达载体p BI121-Gh FLP5,转化拟南芥,观察转基因株系的表型,并用q RT-PCR对其内源基因表达的变化进行测定。【结果】Gh FLP5开放阅读框长300 bp,编码的蛋白质分子量为11.4 k D,共包含3个比较保守的区域,与大豆、苜蓿和毛果杨的开花促进因子亲缘关系较近。空间表达模式分析表明,Gh FLP5在叶片中优势表达,且在早熟品种CCRI50中的表达量显著高于晚熟品种Lu28;时间表达模式分析表明,在CCRI50中其表达量高峰出现在三叶期,而在Lu28中四叶期表达量最高。Gh FLP5的启动子上主要存在两大类顺式作用元件,一类是光响应元件和生物钟元件,一类是胁迫响应元件。根据顺式作用元件的分布和功能选取水杨酸(SA)、脱落酸(ABA)和茉莉酸(JA)喷施处理棉花幼苗,结果表明,Gh FLP5能响应外源SA和ABA而上调,也会被外施JA抑制。组成型表达Gh FLP5的拟南芥株系抽薹时间提前约9 d,开花时间提前约7 d,莲座叶数目减少,差异达到极显著水平。荧光定量的结果表明转基因拟南芥中促进开花的基因LEAFY(At LFY)、SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS(At SOC1)、FLOWERING LOCUS T(At FT)、APETALA1(At AP1)和FRUITFULL(At FUL)表达量显著升高,抑制开花的基因Flowering Locus C(At FLC)表达量显著降低。在转基因拟南芥中生长素应答基因SMALL AUXIN UPREGULATED 20(At SAUR20)和SMALL AUXIN UPREGULATED22(At SAUR22)显著上调,具有生物活性的赤霉素(GA)合成的相关基因GIBBERELLIN 20-OXIDASE 1(GA20OX1)的表达量提高2倍。【结论】转基因拟南芥早花表型明显,Gh FLP5可能在调控中发挥了双重作用,通过IAA和GA途径促进拟南芥的开花转型。     

早熟、优质棉花新品种——中棉所103

简要介绍了中棉所103的选育过程、生物学特性、产量、纤维品质、抗病性及栽培技术要点。     

油脂形成期棉花种子全长cDNA文库的构建

 提取海岛棉7124开花后25～35 d胚的总RNA,利用SMART技术,经21轮LD-PCR扩增获得全长双链cDNA,经SfiⅠ酶切、层析柱分离后,收集500 bp以上的片段与pDNR-Lib载体连接并转化到感受态DH10B细胞,构建了棉花种子全长cDNA文库。所构建的原始文库库容为5×10⁶,文库滴度为1.5×10⁸ cfu·mL^-1。在文库中随机挑取180个克隆进行PCR检测,结果显示,文库中插入片段长度为0.5～2.5 kb,将挑取的180个单克隆进行EST测序,无空载序列,说明文库重组率为100%;序列分析结果表明,其中与油脂形成相关的EST有13条。以上数据说明构建的文库质量较高,为进一步从文库中分离棉花脂肪酸代谢关键基因,提高棉花含油量奠定了基础。     

低酚棉中棉所20遗传特异性与丰产性机理的研究

对中棉所20的低酚等主要性状的遗传特异性研究表明,两对纯合双隐性基因gl#-2gl#-2gl#-3gl#-3能够稳定遗传,花器外观表现为雌蕊柱头短,雄蕊花丝长且早散粉,大大降低异交率。因此,在不隔离种植情况下,可保持低酚棉大田纯度在98%以上。同时,采用拓展亲本来源、复合杂交等手段,克服了低酚棉遗传变异率低,以及遗传单一的弊端。中棉所20综合经济性状优于有酚棉中棉所16,且其叶绿素、蛋白质降低缓慢,SOD、POD酶的含量高、活性强。     

中国短季棉遗传改良研究进展及发展方向

短季棉品种遗传改良是实现麦棉两熟棉区粮棉双丰收的有效途径。从早熟种质资源金字棉的引进,早熟短季棉品种中棉所10号的育成,抗枯萎病品种中棉所16、辽棉10号的选育,生化辅助育种技术育成早熟不衰品种中棉所24、27和36,转单价Bt基因抗虫棉中棉所30、中棉所42和鲁棉研19,转双价Bt＋CpTI基因抗虫棉中棉所50、中棉所58的培育,到航天诱变特早熟品种中棉所64,综述了中国短季棉品种选育的主要研究进展;提出了短季棉育种应加强抗黄萎病材料创制、克服产量和早熟性负相关和解决特早熟品种早衰等遗传改良重点;指出借助分子育种与常规育种技术相结合,培育麦后直播特早短季棉和杂交短季棉是今后短季棉遗传育种的方向。