棉花accD基因植物表达载体的构建与遗传转化的研究

摘要：乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)催化脂肪酸合成的第一步,是脂肪酸合成的限速酶。本研究采用PCR方法分别从陆地棉和拟南芥基因组中扩增出ACCase羧基转移酶β-CT亚基编码基因accD,ACCase羧基转移酶α-CT亚基编码基因CAC3的定位于叶绿体的转运肽序列。将CAC3基因转运肽序列与accD基因进行体外重组,构建融合植物表达载体pBI-CAC3tp-accD。重组质粒通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101。渗透法转化拟南芥,收种子,在含卡那霉素的MS培养基中发芽筛选。用叶盘法转化烟草,经不定芽诱导、生根培养,获转基因烟草植株。T1代转基因拟南芥和转基因烟草植株经卡那霉素检测、PCR、RT-PCR检测后,初步表明目的基因已在植株中转化成功,并可以正常转录。     

芽孢杆菌蛋白酶基因apr的克隆、 表达及序列分析

【研究目的】克隆从新疆吐鲁番地区土样分离获得产蛋白酶菌株Bacillus tequilensis C9蛋白酶基因apr,建立蛋白酶基因异源表达体系。【方法】采用PCR技术克隆获得目的基因,利用生物信息学软件进行序列分析,构建pET-28a原核表达重组质粒,转化BL21大肠杆菌,37℃下IPTG诱导表达融合蛋白,测定酶活。【结果】蛋白酶基因apr全长1098 bp,与Bacillus subtilis aprE (AB734697)有98%的同源性,编码含有299个氨基酸残基的成熟蛋白,是易溶、亲水性较强的蛋白,属于Peptidases_S8_S53 superfamily蛋白家族,融合蛋白分子量为29 kDa,蛋白酶酶活为28.4 u/mL。【结论】试验为构建蛋白酶基因高效表达体系奠定理论基础。     

含有MAR序列的STI-STII-LTB融合基因在苜蓿中的表达

产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)LT和ST是导致人和动物腹泻的主要病原菌。利用三引物PCR法和酶切实现了STI、STII、LTB基因的融合,LTB基因的5′位于STII基因的3′端,三者在同一阅读框。将融合基因STI-STII-LTB构建到带有核基质结合区序列(MARs)的植物表达载体pBI121-MARs中GUS基因的位置。同时构建不含MARs序列的重组质粒。重组质粒pBI121-MARs-STI-STII-LTB、pBI121-STI-STII-LTB通过冻融法转化根癌农杆菌,并通过农杆菌介导法转化杂花苜蓿。转基因苜蓿植株经PCR检测、Southern-blotting分析表明,转基因苜蓿植株基因组中可检测到STI-STII-LTB融合基因;提取转基因苜蓿植株总蛋白质,SDS-PAGE结果显示,转基因植株表达了重组抗原蛋白,且含MAR序列的蛋白表达量要高于不含MAR序列的表达量;Western-dotting免疫检测证实转基因植株表达的重组抗原具有免疫原性。     

蔗糖转运蛋白VvSUC11和VvSUC12累加作用对提高转基因甜菜含糖量的影响

【目的】甜菜是重要的糖料作物,块根中的蔗糖含量是其品质的决定因子。利用基因工程技术将葡萄蔗糖转运蛋白基因（VvSUC11和VvSUC12）导入甜菜块根中,以了解蔗糖转运蛋白是否能提高甜菜的含糖量。【方法】利用葡萄蔗糖转运蛋白基因VvSUC11和VvSUC12构建的根特异性表达植物双价表达载体（pCAMBIA2301-SP1-VvSUC11-SP2-VvSUC12）,通过农杆菌介导法转化到甜菜（Beta vulgaris L.）品种KWS-9103中。利用PCR和RT-PCR技术检测目的基因是否整合到甜菜中并表达。将获得的转基因甜菜和对照甜菜生根后移栽大田,对其叶片性状、相关的生理指标、块根重和含糖量进行测定。【结果】通过PCR和RT-PCR检测,获得13株转基因甜菜。测得转基因植株叶长、叶宽、叶柄长和叶片数量平均分别为25.16 cm、19.31 cm、29.17 cm和38.33个,与对照相比,叶宽增加31.81%,叶柄缩短16.61%,叶片数目增加17.04%,都存在极显著差异,而叶长增加1.68%,无显著差异;叶绿素a含量（1.31 mg•g-1）、叶绿素b含量（0.562 mg•g-1）和叶绿素总含量（1.87 mg•g-1）与对照无显著差异;叶中可溶性糖含量（14.59 mg•g-1）降低13.04%,与对照（16.51 mg•g-1）存在极显著差异,叶柄中可溶性糖含量（21.90 mg•g-1）增加3.36%,但与对照（21.6 mg•g-1）差异不显著;单株转基因甜菜的块根重和含糖量分别平均为3.067 kg和183.2 g•kg-1,与对照（2.894 kg）相比,块根增重5.91%,差异不显著,含糖量增加9.41%,与对照（167.5 g•kg-1）存在显著差异。说明转基因甜菜叶面积和叶片数的增加,扩大了其光合叶面积,同时叶柄缩短有利于提高糖分子从源叶到库的转运,促进甜菜块根的形成和加快糖分的积累。【结论】利用蔗糖转运蛋白VvSUC11、VvSUC12能够有效地提高转基因甜菜的含糖量。     

新疆伽师瓜高效再生系统建立及抗真菌病基因转化

成熟子叶切块作为外殖体,经过组织培养获得再生植株。以MS作为基本培养基,取3日龄子叶块外殖体,选用MS 6-BA1.5 mg/L IAA0.3 mg/L诱导丛生芽,最高诱导率可达78%。而且分化再生过程,6-BA的浓度逐渐降低。在生根培养时,用MS 0.3 mg/L NAA诱导生根率较高,根系粗壮。在建立甜瓜高效再生体系的基础上,用根癌农杆菌介导法将几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因导入新疆甜瓜中,经卡那霉素的抗性筛选,获得转化的再生植株。用PCR反应及Southern-blot检测,进一步研究了再生植株的基因整合与表达情况。经PCR扩增反应和Southern-blot检测均得到了与阳性对照一致的特异性带,可初步证明外源基因已整合到了甜瓜基因组中。     

K88菌毛基因的克隆及ST表位序列在菌毛基因上的融合

[目的]为了建立用于细胞表面展示的载体系统。[方法]利用PCR技术,以大肠杆菌质粒为模板扩增K88菌毛操纵子的结构基因faeC~faeH,并克隆到pBR322质粒载体中。合成一段替换序列,在菌毛抗原基因的超变区引入酶切位点ApaI和NcoI,合成耐热肠度素STII表位编码序列,并引入菌毛抗原基因的超变区。[结果]经PCR鉴定和限制性内切酶酶切证明,重组质粒pBR-fae插入片断大小为6.6kb,与预期相符。核苷酸序列分析证明,所得faeC~faeH序列正确。PCR筛选和测序验证证明,构建了K88菌毛-耐热肠度素STII的融合基因。[结论]试验成功获得了重组质粒pBR-fae-ST。     

天山雪莲SikP基因提高类黄酮质量分数的研究

通过分子克隆技术人工调控天山雪莲类黄酮代谢过程,以提高其类黄酮质量分数。采用农杆菌介导法将SikP基因的植物表达载体转入天山雪莲叶片,成功获得转SikP基因天山雪莲抗性愈伤组织及从生芽;提取并检测对照组和转SikP基因天山雪莲的类黄酮,结果显示,转SikP基因天山雪莲的类黄酮质量分数明显提高,是对照组天山雪莲类黄酮质量分数的9.63倍。说明,天山雪莲Myb转录调控因子SikP基因对天山雪莲次生代谢具有重要的调控作用,能够有效地提高天山雪莲类黄酮的质量分数。     

真菌诱导子调控紫草素合成的分子机制探究

为探讨真菌诱导子调控紫草素合成的分子机制，以新疆紫草无菌苗为试材，经尖孢镰刀菌、立枯丝核菌制备成的诱导子生物诱导后，对其根部进行RNA测序和分析。结果表明，与对照组比较，尖孢镰刀菌试验组差异表达基因1 735个；立枯丝核菌试验组差异表达基因1 043个。GO(gene ontology)分析发现，2个试验组差异表达基因主要富集在细胞过程、细胞组分中膜和分子功能中催化活性等生物学过程。KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)分析发现，2个试验组在植物与病原菌互作、植物激素信号转导途径和苯丙素合成等通路均有大量差异表达基因富集。2个试验组差异表达情况相同的转录因子主要包括bHLH、AP2/ERF-ERF和LOB等，并发现参与紫草素合成及其正向调控的AeGHQH、AeDSH1、AeAP、AePAL、AeDI2、AePGT、AeHMGR、AeG10H基因在2个试验组均上调表达，其中尖孢镰刀菌试验组上调表达较显著。以上结果从分子水平探究了新疆紫草对真菌诱导子生物诱导的响应机制，为未来真菌诱导子应用于新疆紫草种植生产奠定了理论基础。     

陆地棉GAI基因原核表达与多克隆抗体制备

 DELLA蛋白是GA信号响应的关键负调节因子,本文采用基于EST的电子克隆方法,从棉花中克隆了DELLA蛋白家族的一个成员GhGAI。根据电子克隆序列,从陆地棉花胚珠cDNA中扩增得到GhGAI全长基因片段。将其在原核中表达,得到了分子量（Mr）为62000的蛋白质条带。表达蛋白经His-Tag亲和层析纯化后,对兔子进行免疫,制备的抗血清通过间接ELISA检测,具有较高的效价和特异性。     

铜绿假单胞菌脂肪酶Lipase基因的原核表达(英文)

[Objective] The aim of this study was to investigate the prokaryotic expression of pseudomonas aeruginosa Lipase gene.[Method]Lipase gene was amplified by PCR from the genome DNA of pseudomonas aeruginosa,and its nucleotide sequence was determined.The prokaryotic expression vector of Lipase gene was constructed by the gene recombination technique.The protein expression was induced for 4 hours by IPTG with the final concentration of 1.0 mmol/L,and then SDS-PAGE electrophoresis was analyzed.[Result]The sequence of mature peptides in Lipase gene cloned from pseudomonas aeruginosa had a 99.36% homology with that of pseudomonas aeruginosa lipase submitted in NCBI,so the prokaryotic expression vector of Lipase gene pET32a-Lip was successfully constructed.Furthermore,the results of SDS-PAGE electrophoresis showed that the target gene was expressed highly and effectively.[Conclusion]The cloned pseudomonas aeruginosa lipase with its signal peptide could be normally expressed in E.coli and also used for further study.