大豆体细胞胚胎组织培养及遗传转化研究进展

大豆体细胞胚胎遗传转化体系是提高外源基因遗传稳定性,克服嵌合体的有效途径,因此建立高效稳定的大豆体细胞胚胎组织培养体系并广泛应用于大豆的遗传转化是完善大豆遗传转化研究的重要研究内容。本文从大豆体细胞胚胎再生体系研究和转基因研究方法两个方面阐述了大豆体细胞胚胎再生体系的研究进展,并对影响大豆体细胞胚胎遗传转化的影响因素进行了探讨。     

利用Shuffling技术改良纤维素葡聚糖内切酶(EGI)酶活

本文以纤维素葡聚糖内切酶基因为基础,利用shuffling改组技术,经过DNaseI降解、PrimerlessPCR、TouchdownPCR对纤维素内切酶基因进行了突变和改组,然后将改组的纤维素内切酶基因插入原核表达载体pET-28a(+)中,构建了重组子突变体库。通过羧甲基纤维素钠(CMC-Na)培养基的分离筛选,得到活性比较高的纤维素葡聚糖酶菌株。对这些菌株通过3,5-二硝基水杨酸法(DNS)进行酶活检测,成功获到比原来酶活高5.75倍的菌株,酶活表达量56.52U/mL,对其诱导表达条件进行优化结果表明在50℃,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)终浓度为0.1mmol/L条件下,酶的产量最高。     

大豆KTi基因和BBi基因双价RNAi表达载体的构建

以KTi基因的ihpRNA种子特异性表达载体p7αP-GUS-KTiS为模板,采用PCR技术克隆含有KTi基因的完整ihpRNA构件,并将其克隆到pMD18-T载体,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析,并进行序列比对;然后以BBi基因ihpRNA种子特异性表达载体p7αP-GFP-BBiS为基础,利用限制性内切酶BstⅪ单酶切,将KTi基因的完整ihpRNA构件连入其中。最后利用冻融法转化根癌农杆菌,并进行PCR鉴定。结果表明:PCR扩增得到含有KTi基因的完整ihpRNA构件,构建成重组克隆载体pMD18-T-KRNAi,并构建成双价ihpRNA种子特异性表达载体pKTi-BBi-RNAi,并转化得到含有pKTi-BBi-RNAi的农杆菌EHA105。成功构建同时具有大豆胰蛋白酶抑制剂KTi基因和BBi基因的双价RNAi种子特异性表达载体,KTi基因和BBi基因的ihpRNA表达框架成功转入农杆菌中。     

广谱抗病基因chi和hrpZpsta双价表达载体的构建及其在大豆中的遗传转化

大豆的真菌性病害已经成为了限制大豆产量增长及品质提高的主要原因,利用基因工程技术培育出具有广谱性抗病能力的大豆新品种,已成为目前提高大豆抗性的有效途径之一。本研究构建了含2种广谱抗病基因chi和hrp Zpsta的双价植物表达载体,利用农杆菌介导技术导入大豆中,获得了能够在转录水平上表达2种外源抗病性基因的转基因大豆。对经抗性筛选得到的阳性苗及后代植株进行PCR检测、Southern杂交、荧光定量PCR检测,共得到T0代阳性植株7株,T1代阳性植株27株。转化植株的基因组在整合外源基因时出现不同情况,chi-hrp Zpsta双价载体分别以单价和双价两种形式随机整合到受体大豆基因组中并且能稳定遗传,同时在转录水平上亦有不同。     

高产高油中晚熟广适性春大豆新品种吉农27号的选育

大豆新品种吉农27号是以荷引10为母本,以吉农8601-26为父本,经品种间有性杂交,按系谱法经多年系统选育而成.2006～2007年参加北方春大豆品种区域试验,平均产量2617.5 kg/hm2,比对照吉林30号增产6.2%;2008年参加北方春大豆品种生产试验,平均产量3 106.5 kg/hm2,比对照吉林30号增产4.9%.粗蛋白含量为38.18%,粗脂肪含量为21.66%.该品种2009年6月通过全国农作物品种审定委员会审定,其主要特点是高产、优质、抗病、适应性广.     

杂交组合同异评估法在大豆高产、优质育种中的应用

采用杂交组合同异评估方法,对2013-2014年度吉林农业大学的20个大豆杂交组合进行了以产量、脂肪和蛋白质为主要育种目标的分析,以期高效地筛选出符合育种目标的优秀杂交组合,提高育种效率。结果表明:以产量为主要育种目标时,表现优良的一等组合有ARIRA×吉林38、吉林38×ARIRA、ARIRA×意3、EXP×ARIRA、吉林38×吉林47、意3×吉林47,表现较好的二等组合有意3×ARIRA、ARIRA×EXP、吉林47×EXP、ARIRA×吉林47、意3×EXP、吉林38×意3,剩余的8个组合均表现一般,被评为三等组合;以脂肪为主要育种目标时,一等组合是ARIRA×吉林38、吉林38×ARIRA、ARIRA×意3、EXP×ARIRA、意3×ARIRA、ARIRA×EXP,二等组合是吉林38×吉林47、意3×吉林47、吉林47×EXP、ARIRA×吉林47、意3×EXP、吉林38×意3,其余8个为三等组合;以蛋白质为主要育种目标时,一等组合是ARIRA×吉林38、吉林38×ARIRA、ARIRA×意3、EXP×ARIRA、意3×ARIRA、ARIRA×EXP,二等组合是吉林38×吉林47、意3×吉林47、吉林47×EXP、ARIRA×吉林47、意3×EXP、吉林38×意3,其余8个为三等组合。在产量育种目标下,吉林47×EXP与EXP×吉林47、意3×吉林47与吉林47×意3、吉林38×意3与意3×吉林38和ARIRA×吉林38与吉林38×ARIRA这4对正反交组合的综合同一度差异较大;在脂肪和蛋白质育种目标下只有ARIRA×吉林38与吉林38×ARIRA这对正反交组合综合同一度差异较大。根据不同的育种目标,一等组合应该在下一年种植时扩大种植面积,二等组合应着重于去发现表现优秀的植株,而三等组合如果没有特殊的利用价值则无需再多加考量,可以淘汰。     

乳酸乳球菌食品级表达载体的改造（摘要）

[目的]改造乳酸乳球菌食品级表达载体,拓宽原系统的应用范围。[方法]以pNZ8149为基础,在pNZ8149的启动子PnisA下游插入乳酸乳球菌MG1363未知分泌蛋白（Usp45）的胞外分泌信号肽基因序列SPusp45,利用特异性引物通过PCR方法删除启动子序列和信号肽基因序列间的酶切位点,确保SD序列和起始密码子间的距离相对最佳,构建分泌表达载体pNZS。将报告基因gus重组到pNZS的多克隆位点中,构建pNZS-gus,电击转化L.lactisNZ3900。以10ng/ml的nisin诱导培养,取培养液进行GUS染色试验。[结果]新构建的L.lactisN3900/pNZS-gus系统可以正确表达有活性的GUS蛋白,并可以将GUS蛋白分泌到细胞外。[结论]该系统的构建成功,为目的蛋白的分泌性表达研究和口服级疫苗的研制奠定了基础。     

应用正交试验法优化玉米幼胚诱导胚性愈伤的研究

[目的]为提高不同玉米自交系幼胚胚性愈伤组织诱导提供参考。[方法]以玉米幼胚为外植体,对其进行诱导和继代,通过正交试验设计L16（4^5）,研究不同品种、蔗糖浓度、pH值、2,4-D浓度4个因素及水平对非胚性愈伤组织转化为胚性愈伤组织的影响。[结果]各因素对诱导胚性愈伤组织的影响次序是：品种〉pH值〉2,4-D浓度〉蔗糖浓度,其中品种和pH值均达到极显著水平。各品种产生胚性愈伤由易到难的顺序依次是：H99〉D988〉7922〉D598。诱导产生胚性愈伤组织的最优组合为A1B4C4D1,即玉米自交系H99、蔗糖浓度35.0 g/L、pH值5.8、2,4-D浓度1.0 mg/L。[结论]基因型是影响胚性愈伤组织产生的最主要因素,培养基酸碱度对胚性愈伤组织的产生影响较大。     

影响羊草愈伤组织分化因素的研究

[目的]探索影响羊草愈伤组织分化及再生的因素,为羊草组织培养及转基因受体系统建立提供理论依据。[方法]选取5种类型羊草种子进行组织培养,研究在愈伤组织继代、分化培养过程中培养基类型、激素种类和浓度、低温处理等因素对分化率的影响。[结果]不同种群的羊草愈伤组织分化率差异极大;在愈伤组织诱导和继代过程中添加2.0mg/L2,4-D有利于羊草胚性愈伤组织再生能力的保持;继代培养时,不同种类培养基对分化率影响不大,低温处理不能提高长时间继代培养愈伤组织的分化率;分化培养时,外源激素对提高羊草分化率作用不大。[结论]影响羊草愈伤组织分化率的因素主要包括种质资源以及诱导和继代过程中的激素浓度。     

用于SSR分析的大豆干种子DNA提取条件的优化

[目的]探讨适于SSR分析的大豆干种子DNA提取的最佳方法。[方法]以2个大豆品种的干种子为材料,分别采用改良SDS法和CTAB法提取大豆基因组DNA,用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量,用紫外分光光度计分别测定其DNA在A230、A260和A280下的吸光值,根据A260／A230和A260／A280的比值检测DNA的纯度和浓度,并分别以两种DNA为模版进行SSR—PCR扩增。[结果]相同DNA提取条件下,SDS法提取DNA样品的纯度和浓度均高于CTAB法,SDS终浓度为2％（W／V）,水浴15min,氯仿／异戊醇抽提2次时所提取大豆种子DNA的纯度及浓度最高,其DNA的0D260／0D280值为1．86,SDS法所提的DNA泳带分布较集中,无拖尾现象,其DNA浓度能够满足SSR扩增模板的需求。[结论]SDS浓度为2％（W／V）,水浴15min,氯仿／异戊醇抽提2次时提取大豆干种子DNA的浓度和纯度都较高,可以满足后续的各种分子生物学操作的要求。