植物叶绿体遗传转化及研究进展

叶绿体遗传转化与传统的细胞核遗传转化相比具有许多独特的优点：外源基因表达效率高,可同时转化及表达多个基因,由于通过母性遗传,因此没有基因沉默现象及位置效应,也不会造成外源DNA的扩散。目前已经有超过四十多个外源基因整合到烟草等作物的叶绿体基因组中,表现出理想的农艺性状或作为生物反应器表达高水平的生物疫苗。本文对植物叶绿体基因组转化技术的原理和优点,外源基因导入叶绿体基因组的方法,以及目前叶绿体转化研究的最新进展进行了综述,并对其应用进行了展望。     

玉米淀粉分支酶基因片段的克隆和植物表达载体的构建

应用聚合酶链式反应技术(PCR)扩增了玉米淀粉分支酶的cDNA基因片段,并将其克隆到pMD18-Tvector载体上,对重组子进行了PCR检测和限制性内切酶分析,测定了DNA全序列。结果表明：克隆片段全长为935bp。将反义 正义基因片段插入到pB1121 35S启动子下,构建成表达质粒pCJSBE2b。通过花粉管通道法将其导入玉米自交系,获得了转基因植株。     

成熟胚愈伤诱导及再生条件优化

采用三因素随机区组设计,研究不同基因型、培养基种类及2,4-D处理浓度对成熟胚愈伤诱导率的影响。结果表明,影响玉米成熟胚胚性愈伤组织诱导的主要因素是基因型,且基因型、培养基和2,4-D处理对岀愈率影响效果差异达到显著或极显著水平,除初级愈伤三因素互作不显著外,任意两因素或三因素之间的互作效应显著。丹988的最佳培养组合为MN+2,4-2mg/L;铁7922最佳培养组合为MS+2,4-D 2mg/L。添加1mg/L的KT有利于愈伤组织分化。     

正交试验法在玉米组织培养中的应用

利用正交试验研究了培养基、2,4-D、蔗糖、脯氨酸、水解酪蛋白(CH)5个因素及组合对玉米自交系4112和P1幼胚愈伤组织诱导的影响,探讨了正交设计应用于玉米培养基筛选的可能性.结果表明:1)对4112诱导胚性愈伤的最优组合是8114培养基、2,4-D 4 mg/L、蔗糖80g/L、CH 500mg/L,对P1最优组合是蔗糖N6培养基、2,4-D 1 mg/L、蔗糖20 g/L、脯氨酸1 400mg/L、CH 500mg/L;2)不同玉米自交系的幼胚需要不同的糖浓度和培养基;3)适宜的2,4-D浓度可提高愈伤组织的诱导率;4)脯氨酸和水解酪蛋白对愈伤组织的形成有一定作用。     

"吉农17号"大豆品种的丰产性和稳定性分析

利用2003—2004年度国家北方春大豆区域试验资料,通过联合方差分析、F测验、新复极差测验、变异系数和高稳系数法,对“吉农17号”和其他13个品种的丰产性和稳产性进行分析和比较,同时利用灰色关联度分析法对2003—2004年大豆区域试验相同地点的4个品种进行综合性评价。结果表明,“吉农17号”大豆品种的丰产性、稳产性都优于其他供试品种,是一个较为理想的北方春大豆中熟高产品种。     

不同玉米自交系对卡那霉素敏感性的鉴定

利用 8个玉米自交系 ,设置 13个卡那霉素浓度 ,研究卡那霉素对玉米种子发芽及生长的影响。结果表明 :卡那霉素对玉米种子发芽率有一定的影响 ,同时能够引起幼苗的白化现象 ,随着卡那霉素浓度的增大 ,幼苗的生长受到明显的抑制 ,白化率也明显增大。     

大豆豆荚特异性启动子的克隆及功能分析

【目的】克隆大豆豆荚特异性启动子,并对其进行功能分析,为研究抗病虫基因在大豆荚中的特异性表达奠定基础。【方法】利用PCR技术克隆得到豆荚特异性启动子(Pod Specific Promoter,PSP)的核心序列,用PSP序列取代质粒pBI121中的CaMV 35S启动子,构建与GUS基因融合的豆荚特异性报告载体pPSP-GUS,通过农杆菌介导法转化烟草"NC89",对转基因植株进行分子生物学检测,将鉴定为阳性的植株经GUS组织化学染色,验证PSP片段的功能。【结果】所获得的豆荚特异性启动子PSP大小为1 270bp,与已报道序列的同源性为98%,具有多种典型的启动子表达调控元件,如A/T-rich core、CAATBOX、TATABOX、GATABOX等。将pPSP-GUS质粒转化烟草后,经PCR和Southern blot检测结果显示,成功获得了转基因阳性烟草植株。GUS活性检测结果显示,在转pPSPGUS质粒的烟草根和叶片中均未检测到GUS活性,在萼片中可检测到低水平的GUS活性;而在花荚中可检测到高水平的GUS活性,且明显高于转pBI121质粒的对照植株。【结论】克隆得到的豆荚特异性启动子PSP片段具有启动基因在豆荚中特异性表达的功能。     

大豆胰蛋白酶抑制剂KSTI3基因的克隆及其植物表达载体的构建

以大豆基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)技术克隆了大豆胰蛋白酶抑制剂基因KSTI3的全长DNA片段,并将其构建到pMD18-T vector上。核苷酸序列测定结果表明:该基因片段全长654 bp,与已发表的KSTI3基因序列同源性达99%。将反义 正义基因片段插入到pBI121 35S启动子下,构建重组质粒pBIKSTI3。通过冻融法将该重组质粒转入根癌农杆菌EHA105中,获得了植物表达载体。     

基因枪法将BADH基因转入羊草的研究

用PDS-1000He型基因枪将BADH基因转入由羊草成熟胚诱导出的胚性愈伤组织中,获得了转基因植株。通过Kanamycin筛选鉴定,优化了基因枪法转化羊草的各种参数。结果表明,DNA金弹到靶细胞的距离为9cm,每皿轰击1次时愈伤组织的瞬时表达率高达88.13%。转基因植株经PCR检测,初步证明外源基因已整合到羊草基因组中并得以表达。     

农杆菌介导轮状病毒抗原蛋白基因VP7转化紫花苜蓿的研究

以公农1号紫花苜蓿5～7日龄无菌苗子叶为材料,通过农杆菌介导法将轮状病毒抗原蛋白基因VP7转入紫花苜蓿子叶中,并用卡那霉素进行筛选获得抗性植株.提取转化抗性植株叶片DNA作模板,用VP7基因特异引物进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳分析表明有7株扩增出了960bp的特异条带.对7株PCR阳性植株进行PCR- Southern杂交和Southern杂交分析,有4株出现阳性杂交信号,表明目的基因已经整合到紫花苜蓿基因组中,并且是1～2个拷贝.