香蕉条斑病毒LAMP快速检测方法的建立

 环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是一种特异、灵敏、快速的新型基因检测技术。本研究以香蕉条斑病毒（Banana streak virus,BSV）ORF3保守区域为基础针对6个特定区域设计并筛选了4条LAMP扩增引物,通过对LAMP反应中MgSO₄、dNTPs、Betaine等主要试剂浓度进行优化,建立了香蕉BSV的LAMP检测方法,63℃反应90 min后通过在反应产物中添加SYBR Green Ⅰ染料后颜色的变化,肉眼即可判断检测结果。LAMP具有极高的检测特异性和灵敏性,其检测下限约为3.2 ng·μL^-1,是PCR检测灵敏度的25倍,能快速、准确地对疑似样品进行检测,本研究对华南地区部分疑似样品的检测结果显示LAMP阳性检出率比PCR检出率高。本文建立的BSV LAMP检测方法是对BSV检测方法的拓展和延伸,为香蕉病毒的快速检测提供技术保障。     

香蕉枯萎病病原菌海藻糖合成酶基因tps1

为了解tps1基因在尖镰刀菌古巴专化型生理小种1号和生理小种4号之间及与其他镰刀菌之间的差异,分析推测tps1基因与两生理小种之间的寄主选择性差异的关系,通过比对现有镰刀菌属的海藻糖合成酶基因序列,参照尖孢镰刀菌番茄专化型的tps1基因序列设计并合成引物,采用PCR和RT-PCR方法扩增了两个生理小种的tps1基因并测序进行比较分析,同时对香蕉与粉蕉苗诱导两个生理小种后的tps1基因表达量变化进行分析。结果表明,两个生理小种tps1基因全长均为1660 bp,开放阅读框均为1605 bp,编码535个氨基酸,基因序列间仅存在两个碱基位点的差异,编码蛋白间无差异;两生理小种的tps1基因序列与镰刀菌属其他种间存在较大的差异,经寄主诱导后的两个生理小种的tps1基因表达量呈现不同的变化。从tps1基因序列及其编码蛋白的氨基酸序列在两生理小种之间的差异性分析结果推测,两个生理小种寄主选择性差异与tps1基因并无明显对应关系,这为进一步研究tps1基因与病菌在无寄主下的长期生存的关系奠定了基础。     

香蕉枯萎病菌ste12基因的克隆与序列分析

为了解ste12基因在尖孢镰刀菌古巴专化型侵染香蕉过程中的作用,及其与尖孢镰刀菌古巴专化型1号和4号生理小种之间的致病力差异关系,采用PCR和RT-PCR方法扩增了2个生理小种的ste12基因,并对扩增产物进行了测序及相似序列搜索和比对,还对基因编码的蛋白进行了氨基酸序列比对和分析。研究结果表明,2个生理小种ste12基因开放阅读框均为2070 bp,存在7个碱基的差异,基因同源性为99.7%。编码689个氨基酸,氨基酸序列一个有差异。根据生物信息学软件预测编码蛋白没有信号肽,具有两个相同的功能位点,分子量和PI分别为75 ku和6.47。     

复合微生物肥料对香蕉枯萎病防控作用研究

采用盆栽试验,研究以枯草芽孢杆菌BLG010和淡紫拟青霉E16这2株防控香蕉枯萎病的专利菌株制备的3种复合微生物肥料(CMF1、CMF2和CMF3)对香蕉枯萎病发病率、香蕉生长指标、病原尖孢镰刀菌FOC和生防菌株BLG010和E16在香蕉根际定殖情况的影响。结果表明:(1)施用CMF1、CMF2和CMF3均明显降低香蕉枯萎病的发病率,分别降至60.00%,44.44%,26.67%;(2)与对照相比,CMF1、CMF2和CMF3处理能够显著提高香蕉生物量,株高、茎围、地下部和地上部鲜重,分别提高24.46%~44.80%,40.17%~101.43%,18.78%~47.06%,75.88%~109.11%;FOC数量下降11.57%~49.07%,BLG010和E16在根际中的定殖量分别提高27.55%和32.80%;(3)共聚焦显微镜观察发现根际中尖孢镰刀菌荧光强度减弱,体积缩小;(4)相关性分析表明,香蕉枯萎病发病率与尖孢镰刀菌FOC数量呈正相关,E16菌株数量与BLG010菌株数量呈正相关。施用复合微生物肥料不仅提高了对香蕉枯萎病的防治效果,而且促进香蕉生长和提高根际的生防菌株数量,具有较大生防潜力。     

香蕉枯萎病菌cyp1基因的克隆与序列分析

为了解亲环素基因(cyp1,其编码亲和蛋白)在尖孢镰刀菌古巴专化型生理小种1号和生理小种4号之间及与其他镰刀菌之间的差异,分析cyp1基因与两生理小种之间的寄主选择性差异的关系,通过比对现有镰刀菌属的亲环素基因序列,设计并合成引物,采用PCR和RT-PCR方法扩增了尖孢镰刀菌古巴专化型生理小种1号和生理小种4号2个生理小种的cyp1基因,并测序进行比较分析,同时对编码蛋白进行了氨基酸序列比对和功能分析。结果表明,2个生理小种cyp1基因全长均为1066bp,开放阅读框均为675bp,编码224个氨基酸,基因序列间差异性为0.8%,编码蛋白间仅存在1个氨基酸的差异;两生理小种的cyp1基因序列与镰刀菌属其他专化型或不同种间存在差异性,与不同属之间其他种间的差异最大达50%,比对蛋白序列发现仅存在0.85%的差异,这进一步证明亲和蛋白在真菌中较保守。从cyp1基因序列及其编码蛋白的氨基酸序列在两生理小种之间的差异性分析结果推测,2个生理小种寄主选择性差异与cyp1基因并无明显对应关系,这为进一步研究cyp1基因功能奠定了基础。     

绿僵菌在3种不同培养基上培养时产孢量的影响因素

分析了绿僵菌菌株在3种不同培养基上培养时其产孢量的2个影响因素(初始接种浓度和相对湿度),得出菌株在3种不同培养基上培养时须分别配以适宜的接种浓度和相对湿度,以获取最大产孢量(燕麦培养基:1×107cfu/mL,65%;PPDA培养基:1×106cfu/mL,85%;玉米粉酵母浸膏培养基:1×108cfu/mL,75%)。另外,随继代培养代数增加,菌株在这3种培养基上前五代的产孢量比较稳定,第七代及之后的产孢量明显下降。根据3种培养基不同的功能,在PPDA培养基上培养菌株时要着重注意不同继代培养代数对产孢量的影响,其它2种培养基培养菌株一般不超过五代,产孢量比较稳定。     

拮抗香蕉枯萎病镰刀菌木霉菌株的分离筛选

香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型引起的,目前尚缺乏有效的防治方法,木霉菌是重要的植物病害防治菌,广泛分布于自然界。木霉菌具有广泛的适应性,能杀伤多种重要的植物病原菌且作用机制多种多样。笔者从广东湛江、海南儋州等地152份土样中分离出330株木霉,通过对峙法对木霉菌进行体外拮抗作用测定及评价,选出10株对尖孢镰刀菌有较好拮抗效果的木霉菌;并测定无菌土中木霉与病原菌的种群动态变化,结果表明木霉在土壤中对病原菌有一定的抑制作用。     

甘蓝种传真菌初步研究

采用洗涤检验法和PDA培养基法对来自北京地区的20个甘蓝品种进行了种传真菌检测和初步鉴定.结果表明,干种子和水洗后种子携带的优势菌群为青霉属(Penicillium spp.)、根霉属(Rhizopus spp.)、曲霉属(Aspergillu,spp.)、链格孢属(Alternaria spp.)真菌,种子洗涤悬浮液中主要检测到曲霉属、链格孢属和青霉属真菌;1%NaClO处理后的甘蓝种子中,除中甘8号种子带茵率达到20.0%外,其余品种的种子带茵率均低于5.0%,携带的真菌主要为曲霉属和链格孢属真菌.此外,还从春甘45和红亩紫甘蓝两个品种的种子上分离到镰刀菌(Fusarium spp.).关于甘蓝种传真菌的研究为国内首次报道.     

香蕉枯萎病菌pgx4基因的克隆与序列分析

为了解pgx4基因在尖孢镰刀菌古巴专化型侵染香蕉过程中的作用,及其与尖孢镰刀菌古巴专化型生理小种1号和生理小种4号之间的致病力差异的关系,以尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种和4号生理小种的基因组DNA和cDNA为材料,采用PCR和RT-PCR方法扩增了2个生理小种的pgx4基因,并对扩增产物进行克隆测序后再用生物信息学软件对序列进行比对分析.结果表明:2个生理小种pgx4基因的开放阅读框均为1 395 bp,编码465个氨基酸,且前17个氨基酸均构成该基因的信号肽.通过DNAStar 7.1比对发现,尖孢镰刀菌古巴专化型2个生理小种pgx4基因的核苷酸序列存在25个碱基的差异,而其编码的465个氨基酸中,也有3个氨基酸不同,分析这些核苷酸序列和氨基酸序列的差异可能与尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种和4号生理小种在侵染蕉类不同栽培种时的识别专性寄主机制有一定关系.     

香蕉枯萎病菌基因组编码的植物细胞壁降解酶系统生物信息学分析

真菌细胞壁降解酶基因与真菌的致病性密切相关。利用生物信息学和比较基因组学方法对香蕉枯萎病菌植物细胞壁降解酶基因进行了系统分析,结果表明,Foc4基因组中存在编码各种植物细胞壁降解酶的基因,56%的预测基因可以分泌到胞外而发挥作用;果胶降解酶在香蕉枯萎病菌致病过程中可能发挥重要作用。