中间偃麦草SGT1基因的克隆及其抗病功能的分析

为了探索中间偃麦草SGT1基因在小麦抗病反应中的应用潜力,采用RT-PCR和RACE方法克隆出中间偃麦草SGT1基因,命名为TiSGT1。该基因编码蛋白具有SGT1蛋白典型的功能域结构,与大麦SGT1序列高度同源。通过基因重组技术构建了TiSGT1的高效组成型表达载体,通过基因枪法将该载体转化到小麦品种扬麦12基因组中。对转基因植株PCR、Southern杂交与RT-PCR分析表明,TiSGT1基因可在T0、T1和T2代转基因小麦中遗传和表达。黄矮病、白粉病抗性鉴定结果表明,SGT1的超量表达可以提高小麦对黄矮病、白粉病的抗性,TiSGT1可以作为小麦广谱抗病性改良的潜在基因资源。     

类鼻疽伯克霍尔德菌BPSS0180基因的克隆、原核表达及生物信息学分析

试验旨在对类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia pseudomallei,B.pseudomallea）的BPSS0180基因进行克隆和原核表达,并对其表达蛋白进行生物信息学分析。参照GenBank中类鼻疽伯克霍尔德菌K96243标准株BPSS0180基因序列设计1对引物,对类鼻疽伯克霍尔德菌hn-1株进行PCR扩增获得BPSS0180基因片段。将得到的BPSS0180基因连接到pET-28a （+）载体,构建pET-28a （+）-BPSS0180重组质粒,转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,提取质粒进行酶切鉴定。鉴定正确后,将构建成功的pET-28a （+）-BPSS0180重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blotting进行分析。应用DNAMAN、ProtParam、SOPMA和Protscale对BPSS0180基因序列进行生物信息学分析。结果显示,本试验成功克隆了1 146 bp的BPSS0180基因,诱导表达得到的His-BPSS0180融合蛋白大小约为45 ku,且主要以包涵体形式存在。BPSS0180蛋白的分子式为C₁₇₇₉H₂₈₀₉N₅₄₅O₅₃₆S₇,分子质量为40.6 ku,消光系数为40 575,疏水指数为85.43。其不稳定系数为46.52,属于不稳定蛋白;理论等电点（pI）为5.54,为酸性蛋白;总平均疏水性（GRAVY）是-0.261,为亲水性蛋白。该蛋白的二级结构以α-螺旋（58.79%）和无规卷曲（32.02%）为主,预测其在哺乳动物网织红细胞的半衰期为30 h。本试验结果为进一步探究类鼻疽伯克霍尔德菌的BPSS0180基因提供了一定的理论依据。     

羊种布鲁氏菌dhbC基因的克隆、原核表达及生物信息学分析

试验旨在对羊种布鲁氏菌dhbC基因进行克隆及原核表达,并对其表达蛋白进行生物信息学分析。参照GenBank中布鲁氏菌M5-90株dhbC基因序列信息设计1对引物,通过PCR反应扩增获得dhbC基因片段。将得到的dhbC基因连接到pMD20-T载体,构建pMD20-T-dhbC重组质粒并转化大肠杆菌（E.coli） DH5α感受态细胞,提取质粒进行酶切鉴定。鉴定正确后构建pET28a-dhbC重组质粒,转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞。经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blotting进行分析。运用生物信息学软件DNAMAN及相关在线网站ProtParam、SOPMA及Protscale对dhbC基因编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果表明,试验成功克隆了大小约为1 093 bp的dhbC基因并进行了蛋白表达,表达的融合蛋白大小约为47 ku,且主要以包涵体形式存在。dhbC蛋白的分子式为C₁₈₆₆H₂₉₆₈N₅₄₄O₅₆₂S₁₅,分子质量为42 496.3 u,理论等电点（pI）为5.81,消光系数为33 835,不稳定系数为36.76,疏水指数为86.19,总平均疏水性（GRAVY）为-0.215。预测在哺乳动物网织红细胞的半衰期为30 h,其二级结构以α-螺旋（41.94%）和无规则卷曲（31.46%）为主。     

羊源类鼻疽伯克霍尔德菌BPSS1512基因克隆、原核表达及其蛋白的生物信息学分析

为克隆羊源类鼻疽伯克霍尔德菌BPSS1512基因,并对其编码的蛋白进行生物信息学分析,以类鼻疽伯克霍尔德菌基因组为模板,参照GenBank中Burkholderia pseudomallei K96243株基因组DNA序列（登录号：NC_006351.1）设计引物,PCR扩增BPSS1512基因,构建重组质粒,SDS-PAGE和Western blotting分析其蛋白表达,DNAMAN等软件对BPSS1512基因编码的氨基酸序列进行分析。结果显示,PCR扩增成功得到1 425 bp的特异性条带,BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后得到约为5 000和1 500 bp的条带,表明重组质粒pET-28a-BPSS1512构建成功,IPTG浓度为10 mmol/L,诱导时间8 h为最适宜的诱导条件。BPSS1512基因编码的蛋白质分子质量为53 ku,在包涵体中表达;在BPSS1512蛋白二级结构中,α-螺旋、延伸链和无规卷曲分别占24.05%、14.77%、61.18%,并且疏水性区域分布在-2.0~+2.4之间,说明BPSS1512蛋白具有较强的疏水性,本试验结果可为类鼻疽病的防制提供参考依据。     

基因Ⅳ型戊型肝炎病毒开放阅读框3表达的蛋白(pORF3)对L02细胞基质金属蛋白酶(MMP)表达的影响

为了探讨基因Ⅳ型戊型肝炎病毒开放阅读框3(ORF3)表达的蛋白(pORF3)影响靶细胞基质金属蛋白酶(MMP)表达的分子机制,试验运用蛋白芯片技术对比分析了稳定表达pEGFP-ORF3和pEGFP的L02细胞中基质金属蛋白酶表达谱,筛选出表达水平上调/下调的基质金属蛋白酶.结果表明,在稳定表达pEGFP-ORF3的L02细胞中,TIMP-1、TIMP-2和TIMP-4表达水平均降低.本试验结果为戊型肝炎病毒pORF3对L02细胞中基质金属蛋白酶相关蛋白表达影响的分子机制研究提供了理论依据.     

玉米ZmPR4启动子的克隆及其在小麦幼胚愈伤组织中的活性分析

以玉米B73基因组DNA为模板,通过特异PCR扩增,克隆出玉米启动子ZmPR4序列。序列分析表明,该启动子与AJ969166序列同源性为100%。构建了ZmPR4或玉米泛素基因(Ubiquitin)启动子控制的报告基因GUS的表达载体。通过基因枪介导法转化小麦幼胚愈伤组织。瞬间表达实验表明,在小麦幼胚愈伤组织中,玉米ZmPR4启动子的本底表达活性明显比Ubi启动子的低,但经纹枯病菌诱导后,ZmPR4启动子控制的GUS基因的表达明显增强。PCR检测结果证实ZmPR4启动子在小麦愈伤组织中具有表达活性,能够驱动GUS基因的表达。因此,玉米ZmPR4启动子在小麦抗病基因工程育种中具有潜在的应用价值。     

蝴蝶兰花期调控研究进展

1前言蝴蝶兰以其体态轻盈、花朵硕大、花色秀丽、色泽丰富、观赏期长等非凡特色,被人们誉为“洋兰皇后”,是当今国际花坛中的名花,深受全世界各国人民的喜爱。然而,蝴蝶兰的自然花期一般在每年的3月份前后,此时开花,其商品价值肯定大大降低。因此,人工调控蝴蝶兰的开花期,使之能够在春节等节假日前及时开花,从而增加蝴蝶兰的商品价值,是实现蝴蝶兰商品化生产的必然选择,对于促进蝴蝶兰产业的良性发展具有重要的经济意义和现实意义。近年来我国蝴蝶兰产业的发展十分迅速,蝴蝶兰生产正朝着规模化、工厂化方向发展。因此在我国进行蝴蝶兰花期调…     

过表达香樟CcCBFs提高转基因拟南芥抗寒能力

为系统性研究香樟CcCBFs(CcCBFa、CcCBFb、CcCBFc和CcCBFd)基因在增强抗寒性方面的功能,以香樟无性系EL_6组培苗为试验材料,采用荧光定量PCR技术,分析其在低温(4℃)下的表达情况,结果表明:CcCBFs均可持续且强烈地响应低温信号,且CcCBFa和CcCBFc对低温诱导的响应更加显著;通过农杆菌介导的花序侵染法转化哥伦比亚野生型拟南芥,获得转CcCBFs基因拟南芥种子,并对野生型和T_2代转基因拟南芥种子在4℃条件下的发芽率进行统计,结果显示:转基因拟南芥种子发芽率均显著高于野生型拟南芥,可见过表达香樟CcCBFs能够增强拟南芥种子对低温的抵御能力;此外,对T_2代转基因拟南芥和野生型拟南芥幼苗在低温胁迫下的生理指标进行测定,结果发现,未胁迫处理前转基因与野生型拟南芥SOD活性以及脯氨酸质量分数、丙二醛质量摩尔浓度均无显著差异,低温胁迫处理一定时间后转基因拟南芥SOD活性和总游离脯氨酸质量分数均显著高于野生型,而丙二醛质量摩尔浓度均显著低于野生型拟南芥,且在相同的胁迫条件下转CcCBFa、CcCBFc拟南芥的抗寒生理数据变化更为显著。结合基因表达分析、种子发芽率及抗寒生理指标可知,过表达香樟CcCBFs均能提高转基因拟南芥抗寒能力,其中CcCBFa和CcCBFc在香樟抵御低温胁迫时可能发挥更为重要的调控作用。     

放牧对冷蒿繁殖特性的影响

重度放牧对冷蒿(Artemisia frigida)的有性生殖具有严重的阻碍作用,严重影响其有性生殖;冷蒿生殖枝分化率、生殖枝花序数、种子产量、种子成熟度和发芽率之间在同一牧压下表现并不一致,在不同牧压下存在一定的平衡关系;放牧强度起调节作用是冷蒿对放牧的适应机制.     

羊多杀性巴氏杆菌与布鲁氏菌双重套式PCR检测方法的建立及应用

为了建立一种高灵敏度和强特异性的羊多杀性巴氏杆菌与布鲁氏菌的双重检测方法,根据多杀性巴氏杆菌kmt1基因序列和布鲁氏菌BCSP31基因序列分别设计了内外两对引物,构建了双重套式PCR检测方法。结果表明,该方法可以特异性扩增kmt1和BCSP31片段,并能从多种组织样本的DNA中准确检测到多杀性巴氏杆菌与布鲁氏菌的核酸片段。检测沙门氏菌、猪链球菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、海藻糖巴氏杆菌和斯氏假单胞菌均为阴性;对于kmt1的检测下限为70.9 copies/μL,对于BCSP31检测下限为89.5 copies/μL;用于检测动物的组织样本符合率为100%。建立的方法有良好的敏感性、特异性和适应性,可以用于动物检疫诊断。