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为了成功克隆外膜蛋白16(outer membrane proteins 16, Omp16)基因并对其进行原核表达,试验根据GenBank中羊布鲁氏菌M5-90株外膜蛋白Omp16基因序列(登录号:JF918760.1)设计1对引物,从布鲁氏菌基因组中扩增出大小约为507 bp的目的基因片段,凝胶回收纯化目的片段,连接入pMD20-T质粒,转化E.coli DH5α并测序,测序正确后再亚克隆入pET-28a(+)表达载体,构建重组质粒pET-Omp16,转化入E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导其表达,最后用Western blotting分析方法鉴定诱导得到的蛋白。结果表明,成功构建了pET-Omp16原核表达载体,并在E.coli BL21中表达了Omp16基因,诱导得到的蛋白经鉴定与目的蛋白大小一致,证明成功表达了目的基因。 相似文献
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本试验旨在克隆并表达中国荷斯坦奶牛髓样分化蛋白-2(myeloid differentiation protein -2,MD-2)基因,并用Western blotting进行鉴定。采用RT-PCR技术从中国荷斯坦奶牛外周血白细胞中扩增MD-2 cDNA,并将扩增产物与pMD20-T载体连接,重组质粒经测序鉴定后,构建pET28a-MD-2重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果表明,目的基因含有1个483 bp的开放阅读框,编码161个氨基酸;与黄牛、黑猩猩和小鼠MD-2的cDNA序列同源性分别为99.38%、77.02%、68.12%,氨基酸同源性分别为98.75%、65.00%和58.13%。融合蛋白以包涵体的形式存在,分子质量约为25 ku。说明本研究成功克隆并表达了中国荷斯坦奶牛MD-2 cDNA,为其进一步的功能研究提供了理论依据。 相似文献
65.
根据GenBank公布的羊布鲁氏菌(B.melitensis) M5-90株外膜蛋白(outer membrane protein,Omp)基因序列,设计1对引物,以其全基因组为模板,采用PCR技术对其进行扩增,得到381 bp的目的片段,连接入pMD20-T载体,转化E.coli DH5α感受态细胞;测序正确后,构建pET-28a-Omp10原核表达质粒,再将该质粒转化入E.coli BL21(DE3), IPTG诱导表达融合蛋白His-Omp10,用SDS-PAGE和Western blotting进行分析.结果表明, 成功构建了含Omp10基因的原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中表达了Omp10基因,诱导得到的融合蛋白经鉴定与目的蛋白大小一致,证明Omp10得到成功表达.该试验为布鲁氏菌病的进一步研究奠定基础. 相似文献
66.
乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)是生物体内重要的乙醇代谢酶。生物信息学分析显示家蚕基因组中存在7个ADH编码基因(BmADH1~BmADH7),半定量RT-PCR检测BmADH2、BmADH3、BmADH4和BmADH5在家蚕5龄第3天幼虫的丝腺中表达水平较高,BmADH1、BmADH6、BmADH7在脂肪体中高水平表达。利用直接注射和口器灌喂2种方式,对家蚕5龄第3天幼虫分别以体积分数28%、56%的乙醇进行刺激处理后,调查家蚕体内乙醇的代谢与脂肪体中ADH基因的表达及酶活性变化。半定量RT-PCR检测表明56%乙醇注射处理组家蚕的脂肪体中BmADH1、BmADH6、BmADH7的表达上调,而28%乙醇处理后3个基因的表达基本无变化;酶活性检测表明28%、56%乙醇处理后1 h家蚕脂肪体中的ADH活性均显著升高(P<0.05);气相色谱分析显示家蚕血液中的乙醇会快速转化为乙醛。以上结果表明,家蚕幼虫在受到高浓度乙醇刺激后,通过上调脂肪体内的ADH基因的表达,增强ADH活性,使其参与体内乙醇的代谢过程,以保护蚕体免受高浓度乙醇的伤害。 相似文献
67.
中间偃麦草SGT1基因的克隆及其抗病功能的分析 总被引:3,自引:1,他引:2
为了探索中间偃麦草SGT1基因在小麦抗病反应中的应用潜力,采用RT-PCR和RACE方法克隆出中间偃麦草SGT1基因,命名为TiSGT1。该基因编码蛋白具有SGT1蛋白典型的功能域结构,与大麦SGT1序列高度同源。通过基因重组技术构建了TiSGT1的高效组成型表达载体,通过基因枪法将该载体转化到小麦品种扬麦12基因组中。对转基因植株PCR、Southern杂交与RT-PCR分析表明,TiSGT1基因可在T0、T1和T2代转基因小麦中遗传和表达。黄矮病、白粉病抗性鉴定结果表明,SGT1的超量表达可以提高小麦对黄矮病、白粉病的抗性,TiSGT1可以作为小麦广谱抗病性改良的潜在基因资源。 相似文献
68.
试验旨在对类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei,B.pseudomallea)的BPSS0180基因进行克隆和原核表达,并对其表达蛋白进行生物信息学分析。参照GenBank中类鼻疽伯克霍尔德菌K96243标准株BPSS0180基因序列设计1对引物,对类鼻疽伯克霍尔德菌hn-1株进行PCR扩增获得BPSS0180基因片段。将得到的BPSS0180基因连接到pET-28a (+)载体,构建pET-28a (+)-BPSS0180重组质粒,转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,提取质粒进行酶切鉴定。鉴定正确后,将构建成功的pET-28a (+)-BPSS0180重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blotting进行分析。应用DNAMAN、ProtParam、SOPMA和Protscale对BPSS0180基因序列进行生物信息学分析。结果显示,本试验成功克隆了1 146 bp的BPSS0180基因,诱导表达得到的His-BPSS0180融合蛋白大小约为45 ku,且主要以包涵体形式存在。BPSS0180蛋白的分子式为C1779H2809N545O536S7,分子质量为40.6 ku,消光系数为40 575,疏水指数为85.43。其不稳定系数为46.52,属于不稳定蛋白;理论等电点(pI)为5.54,为酸性蛋白;总平均疏水性(GRAVY)是-0.261,为亲水性蛋白。该蛋白的二级结构以α-螺旋(58.79%)和无规卷曲(32.02%)为主,预测其在哺乳动物网织红细胞的半衰期为30 h。本试验结果为进一步探究类鼻疽伯克霍尔德菌的BPSS0180基因提供了一定的理论依据。 相似文献
69.
试验旨在对羊种布鲁氏菌dhbC基因进行克隆及原核表达,并对其表达蛋白进行生物信息学分析。参照GenBank中布鲁氏菌M5-90株dhbC基因序列信息设计1对引物,通过PCR反应扩增获得dhbC基因片段。将得到的dhbC基因连接到pMD20-T载体,构建pMD20-T-dhbC重组质粒并转化大肠杆菌(E.coli) DH5α感受态细胞,提取质粒进行酶切鉴定。鉴定正确后构建pET28a-dhbC重组质粒,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞。经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blotting进行分析。运用生物信息学软件DNAMAN及相关在线网站ProtParam、SOPMA及Protscale对dhbC基因编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果表明,试验成功克隆了大小约为1 093 bp的dhbC基因并进行了蛋白表达,表达的融合蛋白大小约为47 ku,且主要以包涵体形式存在。dhbC蛋白的分子式为C1866H2968N544O562S15,分子质量为42 496.3 u,理论等电点(pI)为5.81,消光系数为33 835,不稳定系数为36.76,疏水指数为86.19,总平均疏水性(GRAVY)为-0.215。预测在哺乳动物网织红细胞的半衰期为30 h,其二级结构以α-螺旋(41.94%)和无规则卷曲(31.46%)为主。 相似文献
70.
为克隆羊源类鼻疽伯克霍尔德菌BPSS1512基因,并对其编码的蛋白进行生物信息学分析,以类鼻疽伯克霍尔德菌基因组为模板,参照GenBank中Burkholderia pseudomallei K96243株基因组DNA序列(登录号:NC_006351.1)设计引物,PCR扩增BPSS1512基因,构建重组质粒,SDS-PAGE和Western blotting分析其蛋白表达,DNAMAN等软件对BPSS1512基因编码的氨基酸序列进行分析。结果显示,PCR扩增成功得到1 425 bp的特异性条带,BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后得到约为5 000和1 500 bp的条带,表明重组质粒pET-28a-BPSS1512构建成功,IPTG浓度为10 mmol/L,诱导时间8 h为最适宜的诱导条件。BPSS1512基因编码的蛋白质分子质量为53 ku,在包涵体中表达;在BPSS1512蛋白二级结构中,α-螺旋、延伸链和无规卷曲分别占24.05%、14.77%、61.18%,并且疏水性区域分布在-2.0~+2.4之间,说明BPSS1512蛋白具有较强的疏水性,本试验结果可为类鼻疽病的防制提供参考依据。 相似文献