黏类小麦细胞质雄性不育相关基因cMDH的克隆与表达分析

为深入研究黏类小麦雄性不育的分子遗传机制,利用抑制差减杂交技术构建了黏类小麦育性相关基因的二核期SSH文库.经文库筛选后,得到一个在可育文库中表达的与胞质苹果酸脱氢酶基因同源的EST序列.以该EST序列为信息探针,经电子克隆、RT-PCR、PCR克隆与序列分析,获得了小麦胞质苹果酸脱氢酶(cytosolic malate dehydrogenases,cMDH)基因的cDNA与DNA序列,利用荧光定量PCR技术对该基因在不育株和可育株花药中的表达进行了分析,并比较了MDH在小麦不育株和可育株中的活性变化.结果表明,该基因的cDNA序列长1213 bp,编码333个氨基酸;DNA序列长2 908 bp,含有7个外显子和6个内含子;该基因在不育株和可育株花药发育3个时期(单核、二核和三核)的表达均表现为先升后降的模式,而且该基因在不育株花药发育的二核期和三核期的表达相对于可育株被明显抑制;MDH在小麦不育株和可育株中的活性变化趋势与定量结果一致.推测该基因在花粉发育早期表达,它的下调表达可能影响了小麦雄蕊发育过程中的能量供应而导致雄性不育.     

GAPDH基因表达与小麦生理型雄性不育花药败育的关系

为分析三磷酸-甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因与小麦(Triticum aestivum)生理型雄性不育花药败育的关系,本研究以新型小麦化学杀雄剂SQ-1作为诱导剂,普通小麦西农1376为材料,构建了西农1376不育和可育等生理系;采用半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术分析了不育和可育等生理系不同发育时期花药中GAPDH基因的表达模式.结果表明,该基因在正常小麦花粉发育的单核期、二核期和三核期,表达丰度比较一致,没有明显变化,但在化学杀雄剂SQ-1诱导的生理型雄性不育花药中,不同发育期表达量存在显著差异,单核期表达最弱,二核期最高.与同期正常花药相比,GAPDH基因在生理型雄性不育花药三个发育期均呈下调表达,其中在大量花粉粒败育的单核期,表达量下调最显著,其次为三核期和二核期,证明化学杀雄剂SQ-1对GAPDH基因的表达具有明显抑制作用.因此,化学杀雄剂SQ-1诱导小麦生理型雄性不育形成过程中,可能与GAPDH基因表达减少导致细胞中能量供给不足有一定关系.     

内参法在线粒体DNA纯度鉴定中的应用

为了确定普通差速离心法提取的小麦线粒体DNA(mtDNA)的纯度,以小麦肌动蛋白β亚基(β-Actin)、1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亚基(RabcL)和细胞色素C 氧化酶第三亚基(COXIII)基因的片段作为内参标记,依靠聚合酶链式反应(PCR)及琼脂糖凝胶电泳技术,对提取的mtDNA进行了检测.结果表明,普通差速离心法提取的mtDNA中混杂有核DNA和叶绿体DNA(ctDNA).对提取的mtDNA稀释后再进行内参法检测,结果发现,当mtDNA稀释到DNA原液的300～400倍时,混杂其中的核DNA已达不到PCR反应的敏感度,但mtDNA、ctDNA仍能满足作为PCR反应体系模板的要求.此时,提取到的mtDNA可视为无核DNA污染的细胞质基因组DNA.     

一例特异细胞质雄性不育小麦mtDNA特异片段的克隆和测序

以具有同质同核的二角型小麦花药外露不育系与花药不外露突变不育系为试材,对其mtDNA进行了RAPD分析,筛选出特异片段S32-1582、OPAA16-1753,并进行克隆与测序。结果表明:花药外露型不育系与花药不外露型不育系细胞质内mtDNA存在明显差异,而ctDNA之间不存在差异;二角型花药外露型不育系转化为花药不外露型不育系,很可能是由于mtDNA自发的重排引起的。其差异片段S32-1582、OPAA16-1753序列与核基因组上的序列具有同源性;供试线粒体基因组能够在较短的演化时间内发生变异,从而引起二角型花药外露型不育系向花药不外露型不育系的变异,其特异质核互作可能起重要作用。     

小麦雄性不育系中TaPDC-E1a及其调节酶基因的表达特征

为进一步研究杀雄剂SQ-1诱导小麦雄性不育的机制,采用电子克隆的方法分离TaPDC-E1a基因,并利用半定量RT-PCR技术分析该基因及其调节酶基因PDK和PDP的表达特性。结果表明,TaPDC-E1a基因编码388个氨基酸,具有TPP保守结构域,可能存在2个丝氨酸磷酸化位点;与可育系相比,TaPDC-E1a基因在生理型不育系和遗传型不育系中表达下调;PDK基因在生理型不育系中表达下调,而在遗传型不育系中表达上调;PDP基因在可育系及不育系中的表达趋势无明显变化。表明经杀雄剂SQ-1诱导形成的生理型不育系在败育过程中其能量代谢途径更容易受到影响,推测对PDK基因进行调节的上游信号机制在小麦生理型不育系与遗传型不育系中可能不一致。     

三例同核异质雄性不育小麦mtDNA差异片段的比较分析

为了从分子水平鉴别三例同核异质小麦雄性不育材料,利用RAPD技术,对细胞核来自同一普通小麦(Triticum aestivum),细胞质分别来自粘果山羊草(Aegilops kotschyi)、二角山羊草(Ae.bicornis)和斯卑尔脱小麦变种(T.spelta)的三例同核异质小麦雄性不育系的线粒体DNA(mtDNA)进行差异片段的比较分析。结果表明:(1)三种不育系在mtDNA上呈现明显差异;(2)对三种不育系的mtDNA差异片段进行回收、克隆、测序和比对,结果片段OPY01-1517和OPP02-750均与普通小麦mtDNA具有较高的同源性,同源性分别为99%和98%。这为进一步从分子水平鉴别含有斯卑尔脱小麦和二角山羊草细胞质的小麦材料奠定了基础,也为区别不同细胞质雄性不育系提供了一定依据。     

小麦生理型雄性不育系中反式烯脂酰-CoA还原酶基因(TaECR)的克隆及表达分析

超长链脂肪酸(VLCFAs)代谢在花药发育中发挥着重要的作用,而反式烯脂酰-CoA还原酶(trans-2,3-enoyl-CoA reductase,ECR)是催化超长链脂肪酸合成的脂肪酰-CoA延长酶之一.为进一步研究杀雄剂SQ-1诱导小麦雄性不育的机理,根据己报道二穗短柄草(Brachypodium distachyon)ECR基因,采用电子克隆获得序列并设计引物,从小麦(Triticum aestivum)中克隆ECR的开放阅读框cDNA序列,命名为TaECR,将该序列提交至GenBank,登录号为KC222053.序列分析表明,TaECR基因编码310个氨基酸,具有反式烯脂酰-CoA还原酶的经典结构域.表达分析表明,TaECR基因在小麦花药、颖片、叶和根中均有表达,其中在根中的表达量最底;与可育系相比,TaECR基因在生理型不育系三核期中表达急剧下调,在单核期和二核期表达趋势无显著变化,并与其蜡质积累量变化趋势基本一致,这表明TaECR基因调节的超长链脂肪合成途径可能参与了SQ-1诱导的败育过程.     

小麦生理型雄性不育花药绒毡层和孢粉素变化与RAFTIN1表达的关系

 【目的】研究小麦生理型雄性不育花药绒毡层变化、孢粉素累积与RAFTIN1表达间的关系,为揭示小麦生理型雄性不育的机理奠定基础。【方法】以杀雄剂SQ-1诱导的生理型雄性不育系、质核互作遗传型雄性不育系,正常可育近等基因系为试材,通过石蜡切片、细胞荧光染色和荧光定量PCR技术,研究小孢子不同发育时期花药绒毡层的形态变化、孢粉素的累积及RAFTIN1的表达。【结果】单核期生理型不育系花药绒毡层提前降解,分泌孢粉素的含量降低,RAFTIN1提前高表达,使大量孢粉素转运至花粉壁层;二核期和三核期,生理型不育系绒毡层完全退化,停止分泌孢粉素,RAFTIN1呈现明显的下调表达模式。【结论】杀雄剂SQ-1诱导的小麦生理型雄性不育其败育机理与绒毡层的提前降解和定向转运孢粉素的RAFTIN1表达高低直接相关。     

黏类小麦细胞质雄性不育线粒体atp6基因转录本编辑位点

以黏类小麦细胞质雄性不育系ms(Kots)-90-110(A)及其近等可育基因系BC₅F₂为材料,采用克隆测序与PCR产物直接测序方法,对黏类小麦线粒体atp6基因在花药发育各阶段的RNA编辑进行了分析。结果表明,小麦atp6基因保守区DNA序列在供试材料不育系及其近等可育基因系中完全一致,且与普通小麦和提莫菲维小麦atp6基因序列同源性为99%。两种方法测序分析atp6基因转录本保守区RNA编辑的结果规律相似。atp6基因共有15个编辑位点,其中13个发生在密码子的第一和第二位点上,这些位点的编辑都使氨基酸种类发生了变化;有2个发生在密码子的第三位点上,不引起氨基酸种类的变化;其中第6和第7位点是共转录的。随着花药发育时期的推移,各位点的编辑频率逐渐增高。不育系与其近等可育基因系相比,在引入核恢复基因后,各位点的编辑频率明显提高。编辑不充分的转录产物可能会影响线粒体功能的正常发挥,表明黏类小麦细胞质雄性不育与线粒体atp6基因转录本保守区的编辑有一定的相关性。